Ein Enzym- und Serumfreie Neural Stem Cell Culture Modell für EMT Investigation Geeignet für Drug Discovery
Summary
Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.
Abstract
Epithelial zu mesenchymale Transition (EMT) beschreibt den Prozess der Epithel Transdifferenzierung zu Mesenchym. EMT ist ein fundamentaler Prozess während der embryonalen Entwicklung, die auch tritt häufig bei Glioblastom, der häufigsten bösartigen Hirntumor. EMT wurde auch in mehreren Karzinomen außerhalb des Gehirns einschließlich Brustkrebs, Lungenkrebs, Dickdarmkrebs, Magenkrebs beobachtet. EMT ist zentral zur Malignität verknüpft durch die Förderung von Migration, Invasion und Metastasenbildung. Die Mechanismen der EMT Induktions sind nicht vollständig verstanden. Hier beschreiben wir ein in vitro – System für standardisierte Isolation kortikaler neurale Stammzellen (NSC) und anschließender EMT-Induktion. Dieses System bietet die Flexibilität, entweder einzelne Zellen oder Explantation Kultur zu verwenden. In diesem System werden Ratten- oder Maus sind embryonalen Vorderhirns NSC kultiviert in einem definierten Medium ohne Serum und Enzyme. Die NSCs ausgedrückt Olig2 und Sox10, zwei Transkriptionsfaktoren in oligodendroc beobachtetyte Vorläuferzellen (OPC). Mit diesem System Wechselwirkungen zwischen FGF, BMP- und TGF- & bgr;-Signalgebung beteiligt ZEB1, Zeb2 und Twist2 wurden beobachtet , wo TGF & beta; Aktivierung signifikant die Zellmigration verbessert, was auf eine synergistische BMP- / TGFß-Interaktion. Die Ergebnisse weisen auf ein Netzwerk von FGF, BMP- und TGF- & bgr;-Signalgebung in EMT Einleitung und Aufrechterhaltung beteiligt. Dieses Modellsystem ist relevant EMT in vitro zu untersuchen. Es ist kostengünstig und weist eine hohe Reproduzierbarkeit auf. Es ermöglicht auch den Vergleich von verschiedenen Verbindungen bezüglich ihrer Migrationsantworten (quantitative Entfernungsmessung) und Hochdurchsatz-Screening von Verbindungen EMT (qualitative Messung) zu hemmen oder zu verstärken. Das Modell ist daher gut geeignet, Arzneimittel-Bibliotheken für Substanzen zu testen EMT zu beeinflussen.
Introduction
Während mehrere Stadien der embryonalen Entwicklung, verlieren Epithelzellen ihre starke Haftung zueinander (zB tight junctions) und erwerben einen Migrations Phänotyp in einem Prozess namens epitheliale zu mesenchymale Transition (EMT) 1. EMT ist für die Bildung von zusätzlichen Zelltypen, wie beispielsweise die mesenchymalen Neuralleistenzellen erforderlich, eine Population , die 2 aus dem Neuroepithel segregiert. EMT ist nicht nur wesentlich während Embryonalstadien , sondern auch in späteren Phasen des Erwachsenenlebens erforderlich physiologischen Prozesse im adulten Organismus zu halten, wie der Wundheilung 3 und des zentralen Nervensystems (ZNS) Regeneration in Läsionen 4 demyelinisierenden.
Epithelialen Tumoren sind bekannt für Migration, Invasion und Metastasierung von EMT als Initiations Schritt zu reaktivieren, was letztlich zu Krebs Progression führt 1,3. EMT in der Tat ist zentral zu starke Migration 1,3 verknüpft. Die zellulären Schritte conditioning, initiiert, unterziehen und EMT Aufrechterhaltung nicht vollständig verstanden werden und müssen weitere Untersuchungen.
Hier ist ein in – vitro – EMT Modellsystem auf Basis von NSCs, mit definierten Wachstumsfaktoren und Medien (kein Serum und keine Enzymeinsatz) wird vorgestellt. Dieses Modellsystem ist von Bedeutung für die Wissenschaftler auf EMT arbeiten. Die Schnecke, Zeb und Twist Proteinfamilien wurden für EMT sowohl in der Entwicklung und Krankheit 1 als kritisch gezeigt. Die Schnecke, Zeb und Twist Familien sind auch in dem vorgestellten System beteiligt. Das System basiert auf einem bestimmten Bereich des Vorderhirns, die normalerweise nicht EMT Bereitstellen während EMT Induktions für die Untersuchung der anfänglichen Ereignisse einen besonderen Vorteil erfährt.
Das Modellsystem könnte möglicherweise EMT in Epithelien angewendet werden außerhalb des ZNS zu studieren, da Schlüssel EMT-Induktoren wie die Schnecke, Zeb und Twist-Proteine, werden auch während der EMT in Gewebesystemen außerhalb des ZNS gefunden. Dieses Modell system ermöglicht die standardisierte Isolierung von NSCs aus der Entwicklung Cortex Stammzelleigenschaften im Allgemeinen und EMT insbesondere zu studieren. Mit diesem System isolierten wir NSCs, induzierte EMT und studierte die spätere Migration unter der Wirkung von FGF2 und BMP-4. Wir beobachteten, dass FGF und BMP-Signalgebung wirkt mit TGFß Signalzellmigration zu fördern, damit die Modellsystem zu validieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie wurde ein standardisiertes System für die EMT – Analyse unter Verwendung von NSCs beschrieben wird (im Ergänzungs Abbildung 3 zusammengefasst). Die Standardisierung gewährleistet Reproduzierbarkeit (Tabelle 1 und 2). Die NSCs werden von der Entwicklung Cortex abgeleitet, ein Gewebe, das normalerweise nicht EMT unterziehen. Dies ist von Vorteil für die Analyse der frühen Schritte in EMT. Erste Schritte in EMT nicht ausreichend in Tumorzellen untersucht werden, die g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde von der Universität Basel Science Foundation und der Schweizerischen National Science Foundation unterstützt durch einen Zuschuss zu MHS und AG (SNF IZLIZ3_157230) unterstützt. Wir danken: Dr. Tania Rinaldi Burkat für Infrastruktur großzügig bereitstellt; alle Mitglieder der Gruppe Bettler für Diskussionen und Kommentare. Wir danken Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Schweiz) für professionelle und kompetente Installation des Full-HD-MC170 Videokamera (Leica Microsystems, Schweiz).
Materials
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1000 . |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
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