創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル
Summary
Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.
Abstract
間葉移行（EMT）に上皮は、上皮が間葉への分化転換のプロセスについて説明します。 EMTはまた、一般的に最も頻度の高い悪性脳腫瘍、神経膠芽腫で発生胚発生時の基本的な過程です。 EMTは、乳癌、肺癌、大腸癌、胃癌などの脳外の複数の癌において観察されています。 EMTは中心部に移動、浸潤や転移形成を促進することにより、悪性腫瘍にリンクされています。 EMT誘導のメカニズムは完全には理解されていません。ここでは、皮質の神経幹細胞（NSC）の標準化された単離およびその後のEMT誘導のためのin vitroの系を記述しています。このシステムは、単一細胞または移植片培養のいずれかを使用するための柔軟性を提供します。このシステムでは、ラットまたはマウス胚前脳NSCは、定義された培地で培養し、血清酵素を欠いています。 NSCはOLIG2及びSOX10、oligodendrocで観察された2つの転写因子を発現しましたYTE前駆細胞（OPCの）。このシステムを使用して、ZEB1、ZEB2、およびTwist2を含むFGF-、BMP-とTGFβシグナル伝達の間の相互作用は相乗BMP-/TGFβ-相互作用を示唆し、TGFβ活性化大幅に強化された細胞遊走を観察しました。結果は、FGF-、BMP-のネットワークを指し、EMTの誘導および維持に関与することがTGFβシグナリング。このモデル系は、in vitroで EMTを調査するために適切です。これは、コスト効率で、高い再現性を示しています。また、それらの移動応答（定量的な距離測定）に対する異なる化合物の比較を可能にし、EMTを阻害または増強する化合物のハイスループットスクリーニング（定性的測定）。モデルは、したがって、EMTに影響を与える物質の薬物ライブラリをテストするのに適しています。
Introduction
胚発生のいくつかの段階では、上皮細胞は互いに（ 例えば、タイトジャンクション）への強い接着性を失い、間葉移行（EMT）に上皮と呼ばれるプロセスで渡り鳥の表現型を獲得する1。 EMTは、間葉系、神経堤細胞のような追加の細胞型、神経上皮2から分離する集団の形成に必要とされます。 EMTは、胚の段階ではないだけに不可欠であるだけでなく、創傷治癒3および中枢神経系（CNS）病変4脱髄における再生などの成体生物における生理学的プロセスを、維持するために、成人期の後の段階で必要。
上皮性腫瘍は、最終的に癌の進行1,3につながる、移動、浸潤や転移の開始段階として、EMTを再活性化することが知られています。 EMTは確かに集中強いマイグレーション1,3にリンクされています。 Cのセルラーステップonditioning、開始受けるとEMTを維持することは十分に理解し、さらなる調査を必要としていません。
ここでは、定義された成長因子とメディア（無血清および無酵素の使用量）とのNSCに基づいて標準化されたin vitroで EMTモデル系は、提示されています。このモデル系は、EMTの作業科学者のための関連性です。カタツムリ、ゼブとツイストのタンパク質ファミリーは、両方の開発や病気1におけるEMTのために重要であることが示されています。カタツムリ、ゼブとツイスト家族も提示システムに関与しています。システムは、通常、EMTは、EMT誘導中の初期の事象の研究のために特別な利点を提供受けない前脳の特定の領域に基づいています。
このようなカタツムリ、ゼブとツイストタンパク質などのキーEMT誘導剤は、また、CNS外の組織・システムにおけるEMT中に発見されているので、モデルシステムは、潜在的に、CNS外の上皮にEMTを研究するために適用することができます。このモデルのystemは、一般、特にEMTにおける幹細胞の機能を研究するために開発皮質からNSCの標準化された単離を可能にします。このシステムを使用して、我々は、NSCを単離し、誘導されるEMTとFGF2及びBMP4の影響下で、その後の移行を検討しました。そこで我々は、モデル系の検証、FGF-およびBMPシグナリングは、細胞遊走を促進するTGFβシグナル伝達と相互作用することを観察しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究でのNSCを用いたEMTの分析のための標準化されたシステムは、（ 補足図3にまとめた）に記載されています。標準化は、再現性（ 表1および2）を保証します。 NSCを現像皮質、通常はEMTを受けない組織に由来します。これは、EMTにおける初期段階の分析のために有利です。 EMTにおける最初のステップは、十分に遺伝的変化を蓄積してきたし、既にEMTの機能を採?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究は、MHSとAG（SNF IZLIZ3_157230）への助成金によってバーゼル科学財団の大学、スイス国立科学財団によってサポートされていました。私たちは感謝：博士タニアリナルディBurkatを寛大にインフラを提供するため。議論やコメントのBettlerグループのすべてのメンバー。我々は、フルHD MC170ビデオカメラ（ライカマイクロシステムズ、スイス）の専門的かつ有能なインストールのためのゲルハルトDorne（ライカマイクロシステムズ、スイス）をお願いいたします。
Materials
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1000 . |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
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