Un modelo enzima y Cultura Neural Stem Cell libre de suero para la EMT Investigación Adecuado para el descubrimiento de fármacos
Summary
Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.
Abstract
Transición epitelial a mesenquimal (EMT) describe el proceso de epitelio mesénquima en transdifferentiating. EMT es un proceso fundamental durante el desarrollo embrionario que también ocurre comúnmente en glioblastoma, el tumor cerebral maligno más frecuente. EMT también se ha observado en múltiples carcinomas fuera del cerebro incluyendo cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer gástrico. EMT está vinculado centralmente a la malignidad mediante la promoción de la migración, la invasión y la formación de metástasis. Los mecanismos de inducción EMT no se entienden completamente. Aquí se describe un sistema in vitro para el aislamiento normalizado de las células corticales neuronales madre (NSC) y posterior EMT-inducción. Este sistema ofrece la flexibilidad de utilizar cualquiera de las células individuales o cultivo de explantes. En este sistema, de rata o de ratón NSCs del cerebro anterior de embriones se cultivan en un medio definido, desprovisto de suero y enzimas. Las células madre neurales expresan Olig2 y Sox10, dos factores de transcripción se observa en oligodendroccélulas precursoras yte (OPC). Utilizando este sistema, las interacciones entre FGF, BMP y TGF-señalización que implica ZEB1, Zeb2, y Twist2 fueron observada en la que TGF-activación mejora de forma significativa la migración de células, lo que sugiere un efecto sinérgico BMP / TGF-interacción. Los resultados apuntan a una red de FGF, BMP y TGF-señalización de estar involucrados en la inducción y mantenimiento de EMT. Este sistema modelo es relevante para investigar EMT in vitro. Es rentable y muestra una alta reproducibilidad. También permite la comparación de los diferentes compuestos con respecto a sus respuestas de migración (medición de la distancia cuantitativo), y cribado de alto rendimiento de los compuestos para inhibir o potenciar EMT (medición cualitativa). El modelo es, por tanto, muy adecuado para poner a prueba las bibliotecas de drogas para las sustancias que afectan a la EMT.
Introduction
Durante varias etapas del desarrollo embrionario, las células epiteliales pierden su fuerte adherencia entre sí (por ejemplo, las uniones estrechas) y adquieren un fenotipo migratorio en un proceso llamado transición epitelial a mesenquimal (EMT) 1. Se requiere EMT para la formación de tipos de células adicionales, tales como las células de la cresta neural mesenquimales, una población que segrega desde el neuroepitelio 2. EMT no sólo es esencial durante las fases embrionarias, sino también necesaria en etapas posteriores de la vida adulta para mantener los procesos fisiológicos en el organismo adulto, tales como la curación de heridas 3 y la regeneración del sistema nervioso central (SNC) en lesiones desmielinizantes 4.
Los tumores epiteliales son conocidos para reactivar EMT como una etapa de iniciación para la migración, invasión y metástasis, en última instancia conduce a la progresión del cáncer 1,3. EMT es, en efecto vinculado centralmente a la fuerte migración de 1,3. Los pasos celulares de conditioning, iniciar, mantener y someterse a EMT no se entienden completamente y necesitan más investigaciones.
Aquí, se presenta un sistema normalizado in vitro modelo EMT basado en NSCs, con factores de crecimiento definidos y medios (sin suero y sin el uso de la enzima). Este sistema modelo es de relevancia para los científicos que trabajan en la EMT. El caracol, Zeb y twist familias de proteínas han demostrado ser crucial para la EMT, tanto en el desarrollo y la enfermedad 1. El caracol, familias Zeb y la torcedura también están involucrados en el sistema presentado. El sistema se basa en una región específica del cerebro anterior que normalmente no experimenta EMT proporcionar una ventaja particular para el estudio de los acontecimientos iniciales durante la inducción de EMT.
El sistema modelo potencialmente podría ser aplicado al estudio de EMT en el epitelio fuera del SNC, ya que los inductores de la EMT clave, como el caracol, Zeb y las proteínas de la torcedura, también se encuentran durante la EMT en sistemas de tejidos fuera del SNC. Este modelo sistema permite el aislamiento normalizado de células madre neurales de la corteza en desarrollo para estudiar las características de células madre en general y, en particular, la EMT. El uso de este sistema, se aislaron células madre neurales, EMT inducida y estudiamos la posterior migración bajo el efecto de FGF2 y BMP4. Hemos observado que interactúa FGF y BMP de señalización con TGF-señalización para promover la migración de células, validando así el sistema modelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio se describe un sistema estandarizado para el análisis de la EMT que utilizan células madre neurales (que se resumen en la Figura 3 complementario). La estandarización asegura la reproducibilidad (Tabla 1 y 2). Los NSCs se derivan de la corteza en desarrollo, un tejido que normalmente no experimenta EMT. Esto es ventajoso para el análisis de los primeros pasos en EMT. Los pasos iniciales en la EMT no pueden ser estudiados adecuadamente en las células tumorales que se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio fue apoyado por la Fundación Universidad de Basilea Ciencia y la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza con una donación de MHS y AG (SNF IZLIZ3_157230). Agradecemos a: Dr. Tania Rinaldi Burkat generosamente para proporcionar la infraestructura; todos los miembros del grupo Bettler para los debates y comentarios. Agradecemos a Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Suiza) para la instalación profesional y competente de la cámara de vídeo de alta definición completa MC170 (Leica Microsystems, Suiza).
Materials
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1000 . |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
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