EMT जांच के लिए एक Enzyme- और सीरम मुक्त तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति मॉडल ड्रग डिस्कवरी के लिए अनुकूल
Summary
Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.
Abstract
mesenchymal संक्रमण (EMT) को उपकला उपकला mesenchyme में transdifferentiating की प्रक्रिया का वर्णन है। EMT भ्रूण विकास भी है कि आमतौर पर, glioblastoma में होता है सबसे अक्सर घातक ब्रेन ट्यूमर के दौरान एक मौलिक प्रक्रिया है। EMT भी स्तन कैंसर, फेफड़ों का कैंसर, पेट के कैंसर, गैस्ट्रिक कैंसर सहित मस्तिष्क के बाहर कई कार्सिनोमा में देखा गया है। EMT केन्द्र प्रवास, आक्रमण और मेटास्टेसिस गठन को बढ़ावा देने से द्रोह से जुड़ा हुआ है। EMT प्रेरण के तंत्र को पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं। यहाँ हम cortical तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) और बाद में EMT-प्रेरण के मानकीकृत अलगाव के लिए इन विट्रो प्रणाली का वर्णन है। इस प्रणाली के लचीलेपन या तो एकल कक्षों या explant संस्कृति का उपयोग करने के लिए प्रदान करता है। इस प्रणाली में, चूहे या माउस भ्रूण अग्रमस्तिष्क एनएससी एक परिभाषित माध्यम में सुसंस्कृत, सीरम और एंजाइमों से रहित हैं। एनएससी Olig2 और Sox10, दो प्रतिलेखन कारक व्यक्त oligodendroc में मनायाyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं (OPCs)। इस प्रणाली का प्रयोग, FGF-, BMP- और बीच बातचीत TGFβ-संकेत Zeb1, Zeb2 शामिल है, और Twist2 मनाया गया जहां TGFβ सक्रियण काफी सेल प्रवास बढ़ाया, एक synergistic BMP- / TGFβ-बातचीत का सुझाव दे। परिणाम FGF-, BMP- और TGFβ-संकेतन के एक नेटवर्क EMT प्रेरण और रखरखाव में शामिल होने के लिए इशारा करते हैं। इस मॉडल प्रणाली इन विट्रो में EMT जांच करने के लिए प्रासंगिक है। यह लागत प्रभावी है और उच्च reproducibility पता चलता है। यह भी अपने प्रवास प्रतिक्रियाओं के संबंध में (मात्रात्मक दूरी की माप), और यौगिकों रोकना या EMT (गुणात्मक माप) बढ़ाने के लिए उच्च throughput स्क्रीनिंग के साथ विभिन्न यौगिकों की तुलना के लिए अनुमति देता है। मॉडल इसलिए अच्छी तरह से प्रभावित हो रहा EMT पदार्थों के लिए दवा पुस्तकालयों का परीक्षण करने के लिए अनुकूल है।
Introduction
भ्रूण के विकास के कई चरणों के दौरान उपकला कोशिकाओं को एक दूसरे (जैसे, तंग जंक्शनों) को अपने मजबूत पालन खोना और mesenchymal संक्रमण (EMT) 1 करने के लिए एक प्रक्रिया बुलाया उपकला में एक प्रवासी phenotype के अधिग्रहण। EMT ऐसे mesenchymal तंत्रिका शिखा कोशिकाओं के रूप में अतिरिक्त प्रकार की कोशिकाओं के गठन, एक जनसंख्या है कि neuroepithelium 2 से segregates के लिए आवश्यक है। EMT भ्रूण चरणों के दौरान केवल आवश्यक है बल्कि घावों 4 demyelinating में इस तरह के घाव भरने 3 और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) उत्थान के रूप में वयस्क जीव में शारीरिक प्रक्रियाओं को बनाए रखने के वयस्क जीवन के बाद के चरणों में की आवश्यकता नहीं है।
उपकला ट्यूमर प्रवास, आक्रमण और मेटास्टेसिस के लिए एक दीक्षा कदम के रूप में EMT पुन: सक्रिय करने, अंततः कैंसर की प्रगति 1,3 करने के लिए अग्रणी जाना जाता है। EMT वास्तव में केन्द्र मजबूत प्रवास 1,3 से जुड़ा हुआ है। ग के सेलुलर कदमonditioning, की शुरुआत के दौर से गुजर और EMT को बनाए रखने के लिए पूरी तरह से समझ में आ रहा है और आगे की जांच की जरूरत नहीं कर रहे हैं।
इधर, एनएससी पर आधारित एक मानकीकृत इन विट्रो EMT मॉडल प्रणाली, परिभाषित वृद्धि कारक है और मीडिया (कोई सीरम और कोई एंजाइम उपयोग) के साथ प्रस्तुत किया है। इस मॉडल प्रणाली EMT पर काम कर रहे वैज्ञानिकों के लिए प्रासंगिक है। घोंघा, Zeb और ट्विस्ट प्रोटीन परिवारों दोनों के विकास और रोग 1 में EMT के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है। घोंघा, Zeb और ट्विस्ट परिवारों को भी प्रस्तुत प्रणाली में शामिल कर रहे हैं। प्रणाली अग्रमस्तिष्क कि सामान्य रूप से EMT EMT प्रेरण के दौरान प्रारंभिक घटनाओं के अध्ययन के लिए एक विशेष लाभ प्रदान करने गुजरना नहीं करता है की एक विशिष्ट क्षेत्र पर आधारित है।
मॉडल प्रणाली संभावित, सीएनएस के बाहर epithelia में EMT अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है क्योंकि इस तरह के घोंघा, Zeb और ट्विस्ट प्रोटीन के रूप में महत्वपूर्ण EMT inducers, यह भी सीएनएस के बाहर ऊतक प्रणालियों में EMT के दौरान पाए जाते हैं। इस मॉडल एसystem विशेष रूप से सामान्य में स्टेम सेल सुविधाओं और EMT अध्ययन करने के लिए विकासशील प्रांतस्था से एनएससी के मानकीकृत अलगाव की अनुमति देता है। इस प्रणाली का उपयोग करते हुए, हम, एनएससी पृथक प्रेरित EMT और FGF2 और BMP4 के प्रभाव के तहत बाद में पलायन का अध्ययन किया। हमने देखा है कि FGF- और सेल प्रवास को बढ़ावा देने के TGFβ-संकेत के साथ बीएमपी संकेत का आदान प्रदान, इस प्रकार मॉडल प्रणाली को मान्य।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन EMT विश्लेषण के उपयोग एनएससी के लिए एक मानकीकृत प्रणाली में वर्णित किया है (पूरक चित्रा 3 में संक्षेप)। मानकीकरण reproducibility (तालिका 1 और 2) सुनिश्चित करता है। एनएससी, विकासशील कोर्टेक्स से…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अध्ययन एमएचएस और एजी (एसएनएफ IZLIZ3_157230) के लिए एक अनुदान द्वारा बेसल विज्ञान फाउंडेशन के विश्वविद्यालय और स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया। हम धन्यवाद: उदारता बुनियादी सुविधाएं उपलब्ध कराने के लिए डॉ तानिया Rinaldi Burkat; चर्चाओं और टिप्पणियों के लिए Bettler समूह के सभी सदस्यों को। हम पूर्ण HD MC170 वीडियो कैमरा के पेशेवर और सक्षम स्थापना के लिए गेरहार्ड Dorne (Leica माइक्रोसिस्टम्स, स्विट्जरलैंड) (Leica माइक्रोसिस्टम्स, स्विट्जरलैंड) धन्यवाद।
Materials
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1000 . |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
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