Et enzym og Serum-free Neural Stem Cell Culture Modell for EMT Investigation Egnet for Drug Discovery
Summary
Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.
Abstract
Epitelial til mesenchymale overgang (EMT) beskriver prosessen med epitel transdifferentiating inn mesenchyme. EMT er en fundamental prosess under embryonal utvikling som også ofte forekommer i glioblastom, den hyppigste ondartet hjernesvulst. EMT har også blitt observert i flere karsinomer utenfor hjernen, inkludert brystkreft, lungekreft, tykktarmskreft, magekreft. EMT er sentralt knyttet til kreft ved å fremme migrasjon, invasjon og metastasedannelse. Mekanismene for EMT induksjon er ikke fullt ut forstått. Her beskriver vi et in vitro system for standardisert isolering av kortikale nevrale stamceller (NSC) og påfølgende EMT-induksjon. Dette systemet gir fleksibilitet til å bruke enten enkeltceller eller eksplantering kultur. I dette systemet, rotte eller mus embryonale forhjernen NSCs dyrkes i et definert medium, blottet for serum og enzymer. De NSCs uttrykt Olig2 og Sox10, to transkripsjonsfaktorer observert i oligodendrocYTE forløper celler (OPCs). Ved hjelp av dette systemet, interaksjoner mellom FGF-, BMP- og TGFfi-signalering som involverer Zeb1, Zeb2, og Twist2 ble observert der TGFB-aktivering betydelig forbedret celle migrasjon, noe som tyder på en synergistisk BMP- / TGFB-interaksjon. Resultatene peker til et nettverk av FGF-, BMP- og TGFfi-signalering for å være involvert i EMT induksjon og vedlikehold. Dette modellsystem er aktuelt å undersøke EMT in vitro. Det er kostnadseffektivt og viser høy reproduserbarhet. Det gir også mulighet for sammenligning av ulike forbindelser med hensyn til sine migrasjons svar (kvantitativ avstandsmåling), og high-throughput screening av forbindelser til hemmer eller forbedre EMT (kvalitativ måling). Modellen er derfor godt egnet til å teste narkotika biblioteker for stoffer som påvirker EMT.
Introduction
Under flere stadier av embryoutvikling, epitelceller mister sin sterke tilslutning til hverandre (for eksempel tett veikryss) og få en trekkfugl fenotype i en prosess som kalles epitelial til mesenchymale overgang (EMT) 1. EMT er nødvendig for dannelsen av flere celletyper, så som mesenchymale neural crest-celler, en populasjon som segregerer fra neuroepithelium 2. EMT er ikke bare viktig i embryonale stadier, men også nødvendig på senere stadier av voksenlivet for å opprettholde fysiologiske prosesser i organismen voksen, så som sårheling 3 og sentralnervesystemet (CNS) regenerering i demyeliniserende lesjoner 4.
Epiteltumorer er kjent for å aktivere EMT som en innvielse skritt for migrasjon, invasjon og metastasering, til slutt fører til kreft progresjon 1,3. EMT er faktisk sentralt knyttet til sterk migrasjon 1,3. De cellulære trinnene conditioning, initiere, gjennomgår og opprettholde EMT er ikke fullt ut forstått, og trenger videre etterforskning.
Her blir et standardisert in vitro EMT modellsystem basert på NSCs, med definerte vekstfaktorer og media (uten serum og uten enzym bruk) presentert. Denne modellen systemet er av relevans for forskere som arbeider på EMT. Sneglen, Zeb og Twist protein familier har vist seg å være avgjørende for EMT både i utvikling og sykdom 1. Sneglen Zeb og Twist familier er også involvert i den presenterte systemet. Systemet er basert på en spesifikk region av forhjernen som normalt ikke gjennomgår EMT som gir en spesiell fordel for studiet av innledende hendelser i løpet av EMT induksjon.
Modellsystemet kan potensielt brukes til å studere EMT i epithelia utenfor CNS, siden nøkkel EMT-indusere som sneglen, Zeb og Twist proteiner, er også funnet i løpet av EMT i vev systemer utenfor CNS. Denne modellen system tillater den standardiserte isolering av NSCs fra utviklings cortex å studere stamcelle funksjoner generelt og EMT spesielt. Ved hjelp av dette system, isolerte vi NSCs, indusert EMT og studert den etterfølgende vandring under virkningen av FGF2 og BMP4. Vi observerte at FGF- og BMP-signale samhandler med TGFB-signalering for å fremme cellemigrasjon, og dermed validere modellsystemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien ble et standardisert system for EMT analyse som anvender NSCs er beskrevet (oppsummert i Supplementary figur 3). Standardiseringen sikrer reproduserbarhet (tabell 1 og 2). De NSCs er utledet fra å utvikle cortex, et vev som normalt ikke gjennomgår EMT. Dette er fordelaktig for analysering av tidlige trinn i EMT. Første skritt i EMT kan ikke tilstrekkelig undersøkt i kreftceller som har akkumulert genetiske forandringer og kan allerede vedtatt EMT funksjoner. Videre p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien ble støttet av Universitetet i Basel Science Foundation og den sveitsiske National Science Foundation av en bevilgning til MHS og AG (SNF IZLIZ3_157230). Vi takker: Dr. Tania Rinaldi Burkat for sjenerøst gi infrastruktur; alle medlemmer av Bettler gruppe for diskusjoner og kommentarer. Vi takker Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Sveits) for profesjonell og kompetent installasjon av Full HD MC170 videokamera (Leica Microsystems, Sveits).
Materials
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1000 . |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
References
- Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
- Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14 (2015).
- Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
- Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. . Atlas of the developing rat nervous system. , (1994).
- O’Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
- O’Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
- Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
- Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
- Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
- Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
- Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
- Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
- Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
- Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
- Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
- Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
- Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
- Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
- Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
- Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
- Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
- Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
- McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763 (2014).
- Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
- Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
- McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
- Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
- Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
- Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
- Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment – migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).
