En enzym- och Serumfritt Neural Stem Cell Culture modell för EMT undersökning Lämplig för Drug Discovery
Summary
Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.
Abstract
Epitelial till mesenkymala övergång (EMT) beskriver processen för epitel transdifferentiating i mesenkym. EMT är en fundamental process under fosterutvecklingen som också ofta förekommer i glioblastom, den vanligaste elakartade hjärntumör. EMT har också observerats i flera karcinom utanför hjärnan, inklusive bröstcancer, lungcancer, tjocktarmscancer, magsäckscancer. EMT är centralt kopplad till malignitet genom att främja migration, invasion och metastasbildning. Mekanismerna i EMT-induktion är inte helt klarlagda. Här beskriver vi ett in vitro-system för standardiserad isolering av kortikala neurala stamceller (NSCs) och efterföljande EMT-induktion. Detta system ger möjlighet att använda antingen enskilda celler eller Explantation kultur. I detta system, råtta eller mus embryonala framhjärnan NSCs odlas i ett definierat medium, som saknar serum och enzymer. De NSCs uttryckte Olig2 och Sox10, två transkriptionsfaktorer observerades i oligodendrocYTE prekursorceller (OPCs). Med detta system, interaktioner mellan FGF-, BMP- och TGF-signalering involverar Zeb1, Zeb2 och Twist2 observerades där TGFp-aktivering förbättras avsevärt cellmigration, vilket tyder på en synergistisk BMP- / TGF-interaktion. Resultaten pekar på ett nätverk av FGF-, BMP- och TGF-signaleringen att vara involverad i EMT induktion och underhåll. Detta modellsystem är relevant att undersöka EMT in vitro. Det är kostnadseffektiv och visar hög reproducerbarhet. Det gör det också möjligt för jämförelse av olika föreningar med avseende på deras migrations svar (kvantitativ avståndsmätning), och high-throughput screening av föreningar för att hämma eller förbättra EMT (kvalitativ mätning). Modellen är därför väl lämpad att testa bibliotek läkemedels för ämnen som påverkar EMT.
Introduction
Under flera stadier av embryonal utveckling, epitelceller förlorar sin starka vidhäftning till varandra (t.ex. tight junctions) och skaffa en vandrande fenotyp i en process som kallas epitelceller till mesenkymala övergång (EMT) 1. EMT krävs för bildandet av ytterligare celltyper, såsom de mesenkymala neurallist-celler, en population som segregerar från neuroepitelet 2. EMT är inte bara nödvändig under embryonala stadier men också krävs i senare skeden av vuxenlivet för att upprätthålla fysiologiska processer i den vuxna organismen, såsom sårläkning 3 och centrala nervsystemet (CNS) förnyelse i demyeliniserande lesioner 4.
Epiteliala tumörer är kända för att aktivera EMT som ett inledande steg för migration, invasion och metastas, vilket slutligen leder till cancer progression 1,3. EMT är verkligen centralt kopplad till stark migration 1,3. De cellulära stegen att conditioning, initiera, genomgår och upprätthålla EMT är inte helt klarlagda och behöver ytterligare utredning.
Här används ett standardiserat in vitro-EMT modellsystem baserat på NSCs, med definierade tillväxtfaktorer och media (inget serum och inget enzym användning) presenteras. Detta modellsystem är av betydelse för forskare som arbetar på EMT. Snigeln, Zeb och Twist proteinfamiljer har visat sig vara avgörande för EMT både i utveckling och sjukdom en. Snigel, Zeb och Twist familjer är också involverade i den presenterade systemet. Systemet bygger på en specifik region av framhjärnan som normalt inte genomgår EMT ger en särskild fördel för att studera inledande händelser under EMT induktion.
Modellsystemet skulle kunna användas för att studera EMT i epitel utanför CNS, eftersom viktiga EMT inducerare, såsom snigel, Zeb och Twist proteiner, finns också under EMT i vävnadssystem utanför CNS. Denna modell ssystemprogram medger standardiserad isolering av NSCs från utvecklings cortex att studera stamceller funktioner i allmänhet och EMT i synnerhet. Med detta system, isolerade vi NSCs, inducerad EMT och studerade den efterföljande migration under inverkan av FGF2 och BMP4. Vi observerade att FGF- och BMP-signalering samverkar med TGFp-signalering för att främja cellmigration, vilket validerar modellsystemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie ett standardiserat system för EMT analys använder NSCs beskrivs (sammanfattas i tilläggs Figur 3). Standardiseringen säkerställer reproducerbarhet (tabell 1 och 2). De NSCs är härledda från framkallnings cortex, en vävnad som normalt inte genomgår EMT. Detta är en fördel för analys av tidiga stegen i EMT. De första stegen i EMT kan inte studerats tillräckligt i tumörceller som har ackumulerats genetiska förändringar och kanske redan har antagit EMT funkt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien stöddes av University of Basel Science Foundation och Swiss National Science Foundation genom ett bidrag till MHS och AG (SNF IZLIZ3_157230). Vi tackar Dr. Tania Rinaldi Burkat för generöst tillhandahålla infrastruktur; alla medlemmar i Bettler grupp för diskussioner och synpunkter. Vi tackar Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Schweiz) för professionell och kompetent installation av Full HD MC170 videokamera (Leica Microsystems, Schweiz).
Materials
| BMP4, rhBMP4 | RnD Systems | 314-BP-01M | |
| Bovine pancreas insulin | Sigma | I1882 | |
| Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assay | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 well plate system |
| Cell culture dish with grid | Ibidi 500 mm dish, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plasma membrane dye, use at 1:1000 . |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | Stock at 5mg/ml. Use at 1:10000. Cancerogenic. Appropriate protection (gloves, coat, goggles) required. |
| DMEM/F12 1:1 medium bottle | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Systems | 233-FB-01M | |
| Fibronectine, bovine | Sigma | F4759 | |
| Glutamax supplement | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Graphics software with pixel measurement feature | Fiji | fiji.sc/Fiji | version 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| Human apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Possible lung irritant. Avoid inhalation. Use appropriate protection. |
| L-glutamine | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Mouse anti Nestin antibody | Genetex | GTX26142 | Use at 1:100, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Olig2, Rabbit anti Olig2 antibody | Provided by Hirohide Takebayash | Personal stock | Use at 1:2000, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| Penicillin/Streptomycin/Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibody | Acris | DM3614P | Use at 1:250, 4% PFA fixation, avoid Triton X100 |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P3655 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Skin and eye irritant. Appropriate protection required. |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Rabbit anti Sox10 antibody | Millipore Chemicon | AB5774 | Use at 1:200, 4% PFA fixation, Triton X100 at 0.1% |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Systems | 240-B-010 | |
| Uncoated Petri dishes | Falcon Corning | 351029 |
References
- Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
- Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14 (2015).
- Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
- Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. . Atlas of the developing rat nervous system. , (1994).
- O’Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
- O’Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
- Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
- Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
- Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
- Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
- Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
- Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
- Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
- Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
- Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
- Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
- Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
- Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
- Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
- Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
- Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
- Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
- McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763 (2014).
- Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
- Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
- McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
- Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
- Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
- Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
- Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment – migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).
