De<em> Ex vivo</em> Kultur och mönsterigenkänning receptorstimulering av Mouse Intestinal Organoids
Summary
Här är ett protokoll för att skörda, underhålla och behandla mus tunntarmens organoids med patogen associerade molekylära mönster (PAMPs) och Listeria monocytogenes beskrivs, liksom betoning på genuttryck och lämpliga normaliseringsmetoder för protein.
Abstract
Primära tarm organoids är ett värdefullt modellsystem som har potential att avsevärt påverka området mucosal immunologi. Men komplexiteten i de organoid tillväxtegenskaper bära betydande förbehåll för utredaren. Specifikt, tillväxtmönster hos varje individuell organoid är mycket variabla och skapa en heterogen population av epitelceller i odling. Med sådana förbehåll, kan vanliga vävnadsodlingsmetoder inte tillämpas enbart på organoid systemet på grund av komplexiteten i cellstrukturen. Räkna och plätering enbart baserad på cellantal, vilket är vanligt för individuellt separerade celler, såsom cellinjer, är inte en tillförlitlig metod för organoids om inte någon normalisering teknik används. Normalisering till totalt proteininnehåll görs komplex på grund av att den inhemska proteinmatrisen. Dessa egenskaper i form av antalet celler, form och celltyp bör beaktas vid bedömningen av utsöndrat contält från organoid massan. Detta protokoll har tagits fram för att beskriva en enkel procedur till kultur och behandla små tarm organoids med mikrobiella patogener och patogen associerade molekylära mönster (PAMPs). Det understryker också normaliseringsmetoder som ska användas när proteinanalys utförs efter en sådan utmaning.
Introduction
Förmågan att skörda och kultur primära organoids har beskrivits för tunntarmen, kolon, pankreas, lever och hjärna och är spännande framsteg relevant för att förstå en flera fysiologiskt representativt fenomen för vävnadsbiologi 1-5. De första metoderna beskriver kulturen och underhåll av små tarm organoids rapporterades av Sato et al. Ur labbet Hans Clevers en. Före denna metod, skörd och odling av primära intestinala epitelceller visade sig vara begränsade och ineffektiva för att upprätthålla epitelial celltillväxt. Metoder ingår dissociation av vävnad via inkubation med enzymer, såsom kollagenas och dispas, vilket i slutändan skulle leda till utväxt av blandade primära fibroblastceller 6. Dessa villkor skulle också vara tidsbegränsat för att upprätthålla den epiteliala cellkulturen. Minimal eller ingen epitelcell nisch skulle bilda, såsom epitelceller skulle träda apoptos på grund avbristen på lämpliga tillväxtfaktorer eller förlust av kontakt integritet, benämnd anokis 7. Tillkomsten av 3D-organoid odlingssystem har gett en metod att odla primära tarmceller som innehåller ett spektrum av tarmcelltyper i ihållande kultur 1. Dessa epiteliala organoids har fördelar jämfört med cellinjer är att de är sammansatta av flera differentierade celler, och bättre efterlikna det organ de är härledda från in vivo 8. Processen för att slutligen "växa en mini tarmen i en skål" har visat sig vara ett värdefullt verktyg för att utvärdera effekten av tarmepitelet under olika stimuli. Undersöker samspelet mellan primära tarmceller med mikrobiella patogener associerade molekylära mönster (PAMPs) är relevant för området immunologi eftersom dessa molekylära mönster kan reglera olika svar från både värd och mikrob 9. Inte bara kan utredarna nu utforska dessa interaktioner med musen organoids, men dekan odlas från människor såväl 2. Denna teknik har potential att dramatiskt ändra personlig medicin och det är frestande att spekulera om framsteg som denna teknik kommer att göra det möjligt inom en snar framtid.
Det övergripande målet med denna metod är att tillhandahålla ett protokoll för den kultur, expansion, och behandling av tarm organoids med en mängd olika stimuli. Sådana stimulanser kan i slutändan allt från vacciner, bakterie PAMPs, levande patogener, gastrointestinala (GI) och cancerterapi. Den isolering och odling av mus tarm organoids har anpassats från Sato et al. Även om det finns små avvikelser från den ursprungliga metoden, slutprodukten är organoida kulturen fortfarande uppnås vid tillämpningen av detta protokoll. Denna metod är inriktad på att beskriva en lämplig teknik för korrekt normalisering när man arbetar med icke-homogena cellstrukturer, som måste beaktas vid genomförandet av en analys baserad på cell numbra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kulturen och underhåll av tarm organoids är ett förfarande som kan behärskas av någon person med tillräcklig vävnadsodlingsteknik. Det finns nyanser i passaging i jämförelse med odling av celler på ett mer konventionellt monoskikt, men dessa nyanser är inte svåra att övervinna. De kritiska stegen i denna metod involverar att kunna växa de organoids till en tillräckligt hög densitet för optimal ympning. Experiment måste skalas ned med organoids som stora sådd tätheter som ofta kan uppnås med cellinje…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel and Bettina Heid for technical discussions. The authors thank Dr. Nanda Nanthakumar for providing the Caco-2 cells. The authors also thank The Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) at Virginia Tech. This work was supported by the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (to I.C.A.). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (Section 1,3,6) Or equivalent brand |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo | (Section 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells |
| HEK293T-Rspondin1 secreting cell line | (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. | ||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | (Section 1) Or equivalent brand |
| T-175 Flask | Corning | 431079 | (Section 1) Or equivalent brand |
| Protein Matrix | Corning | 356231 | (Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (Section 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (Section 2,3) Advanced DMEM/F12 |
| Corning 24 Well TC Plates | Corning | 3524 | (Section 2) |
| N2 Supplement 100x | Life Technologies | 17502-048 | (Section 2) |
| B27 without vitamin A 50x | Life Technologies | 12587-010 | (Section 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (Section 2) |
| Glutamine Supplement (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| 10ml Serological Pipet | Falcon | 357551 | (Section 2) Or equivalent brand |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (Section 2) Stock = 100 mg/ml |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | (Section 2) Stock = 1M |
| Recombinant Mouse EGF | Biolegend | 585608 | (Section 2) Stock = 500 mg/ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (Section 3) | |
| dissecting scissors | (Section 3) | ||
| forceps | (Section 3) | ||
| glass slides | (Section 3) | ||
| dissecting tweezers | (Section 3) | ||
| 25 ml Serological Pipet | Falcon | (Section 3) | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | (Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher | FB0875712 | (Section 3) Or equal sized TC dish |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | (Section 4) |
| Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305120 | (Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm) |
| Flagellin from Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (Section 5,6) |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 19115 | (Section 5,6) (Murray et al.) |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | (Section 5,6)Or equivalent brand |
| BBL Brain Heart Infusion Agar | Becton Dickinson | 211065 | (Section 5) |
| Bacto Brain Heart Infusion | Becton Dickinson | 237500 | (Section 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (Section 6) |
| Trypsin | gibco | 25200056 | (section 6) |
| Methanol | Fisher | A412-4 | (Section 6) |
| SpectraMax M5 | Molecuar Devices | (Section 6) | |
| 96 Well Assay Plate | Corning | 3603 | (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated |
| Nuclear Staining Dye | Life Technologies | H1399 | (section 6) Hoechst 33342 |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | (Section 6) Or equivalent brand |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | (Section1,3) Or equivalent brand |
| 1.7 ml polypropylene tube | Bioexpress | C-3262-1 | Or equivalent brand |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | Or equivalent brand |
| TNF-alpha | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-18 | Applied Biosystems | Mm 00434225_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Taqman gene expression assay kit |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | 4346907 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C7559 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Freshney, R. I., Freshney, M. G. . Culture of epithelial cells. 2nd edn. , (2002).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123 (6), 1980-1991 (2002).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise review: the relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment. Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309 (5738), 1256-1259 (2005).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 1 (2), 581-585 (2006).
- Allen, I. C., et al. NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-kappaB signaling pathways. Immunity. 34 (6), 854-865 (2011).
- Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiol Rep. 2 (9), (2014).
- Grabinger, T., et al. Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy. Cell Death Dis. 5, 1228 (2014).
- Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts. Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).
- Parry, M. F., Neu, H. C. Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro. J Clin Microbiol. 5 (1), 58-61 (1977).
