Mikroinjektion for Transgenese og Genome Redigering i Trepigget Sticklebacks

Summary

Transgene manipulationer og genom-redigering er kritiske for funktionelt teste roller gener og cis reguleringsmyndigheder elementer. Her et detaljeret mikroinjektion protokol for generering af genomiske modifikationer (herunder Tol2-medierede fluorescerende reporter transgene konstruktioner, Talens og CRISPRs) præsenteres for emergente model fisk, den trepigget hundestejle.

Abstract

Den trepigget hundestejle fisk har vist sig som et kraftfuldt system til at studere den genetiske basis for en bred vifte af morfologiske, fysiologiske og adfærdsmæssige fænotyper. De bemærkelsesværdigt forskellige fænotyper der har udviklet sig som marine populationer tilpasse sig utallige ferskvandsmiljøer, kombineret med evnen til at krydse havvand og ferskvand former, giver en sjælden hvirveldyr system, hvor genetik kan anvendes til at kortlægge genomiske regioner at styre udviklet træk. Fremragende genomiske ressourcer er nu tilgængelige, lette molekylær genetisk dissektion af udviklede ændringer. Mens mapping eksperimenter generere lister over interessante kandidatgener, er funktionelle genetiske manipulationer kræves for at afprøve roller disse gener. Genregulering kan studeres med transgene reporterplasmider og BAC'er integreret i genomet ved hjælp af Tol2 transposasen systemet. Funktioner af specifikke kandidatgener og cis reguleringsmyndigheder elementer kan vurderes ved at inducere målrettetmutationer med talen og CRISPR / Cas9 genom redigering reagenser. Alle metoder kræver indføring af nukleinsyrer i befrugtede én-celle hundestejle embryoer, en opgave gjort udfordrende ved den tykke chorion af hundestejle embryoer og den relativt lille og tynd blastomer. Her er en detaljeret protokol til mikroinjektion af nukleinsyrer i hundestejle embryoner beskrevet for transgene og genom redigeringsfunktioner at studere genekspression og funktion, samt teknikker til at vurdere succes transgenese og inddrive stabile linjer.

Introduction

Et grundlæggende element i at forstå, hvordan biodiversiteten opstår er at bestemme de genetiske og udviklingsmæssige grundlag for udviklede fænotypiske ændringer i naturen. Den trepigget hundestejle fisk, Gasterosteus aculeatus, har vist sig som en fremragende model til at studere den genetiske basis for evolution. Hundestejler har gennemgået mange adaptive evolutionære ændringer som marine fisk har koloniseret utallige ferskvandsmiljøer omkring den nordlige halvkugle, hvilket resulterer i dramatisk morfologiske, fysiologiske og adfærdsmæssige ændringer ^en. Genomerne af individer fra enogtyve hundestejle populationer er blevet sekventeret og samles, og en høj densitet binding kort er blevet frembragt for yderligere at forbedre konstruktionen ^2,3. Genetisk kortlægning eksperimenter har identificeret genomiske regioner underliggende udviklede fænotyper ^{4 – 6,} og i enkelte tilfælde har de funktionelle roller specifikke kandidatgener testet ^7,8. En række genomiske regioner underliggende morfologiske ændringer er blevet identificeret med lovende kandidatgener, men disse kandidater er endnu ikke blevet funktionelt testet ^{9 – 12 år.} Hertil kommer, hundestejler er fælles modeller for studier af populationsgenetik / genomforskning ^13,14, artsdannelse ^15, adfærd ^1, endokrinologi ^16, økotoksikologi ^17, immunologi ¹⁸ og parasitologi ^19. Fremtidige studier i hvert af disse områder vil drage fordel af evnen til at udføre funktionelle genetiske manipulationer i hundestejler. Ud over at manipulere deres kodende sekvenser, kan roller kandidatgener vurderes ved at studere deres cis reguleringsmyndigheder sekvenser og ved funktionelt stigende, faldende eller eliminere ekspression af kandidat-gen. Mikroinjektion og transgenese metoder i hundestejler er veletablerede ^7,8,20 og blev oprindeligt udviklet ved hjælp af en meganuklease-medieretmetode ²¹ først beskrevet i Medaka ^22. Den modificerede mikroinjektion metode præsenteres her er blevet optimeret til både Tol2-medieret transgenese og for nylig udviklet genom redigering reagenser herunder Talens og CRISPRs.

Ændringer i cis reguleringsmyndigheder elementer menes at være kritisk for morfologiske udvikling, som cis reguleringsmyndigheder ændringer kan undgå de negative pleiotropiske konsekvenser af kodende mutationer ^23. Derfor tester og sammenligner formodede cis reguleringsmyndigheder sekvenser er blevet et centralt mål med et stigende antal evolutionære studier. Desuden har de fleste menneskelige sygdom varianter er regulatoriske varianter ^24,25 og model hvirveldyr systemer er hårdt brug for at studere cis reguleringsmyndigheder element funktion og logik. Fisk, der befrugte deres embryoner eksternt i stort tal tilbyde kraftige hvirveldyr systemer til at studere cis -forordning. Det Tol2 transposon system, hvor udenlagn DNA, der skal integreres i genomet flankeres af Tol2 transposase binding sites og co-injiceret med Tol2 transposase mRNA, arbejder med høj effektivitet for vellykket integration plasmidkonstruktioner i fisk genomer ^{26 – 28.} Typisk er en potentiel enhancer klonet opstrøms for en basal promotor (såsom hsp70l ²⁹⁾ og fluorescerende reporter gen, såsom EGFP (forstærket grønt fluorescerende protein) eller mCherry i en Tol2 backbone og injiceret med transposase mRNA ^26. Observation af udtryk for den fluorescerende reporter, enten i injicerede embryoner eller afkom med stabilt integrerede transgener, giver oplysninger om den Spatiotemporal regulering af genekspression drevet af den formodede forstærker. I yderligere eksperimenter, kan validerede enhancere anvendes til at drive vævsspecifik overekspression af gener af interesse.

Til analyse af større cis reguleringsmyndigheder regioner, høj kvalitet, stor-insert genomic biblioteker med bakterie- kunstige kromosomer (BAC'er) er blevet konstrueret til både marine og ferskvands hundestejler ^30. Disse BAC'er kan recombineered at erstatte et gen med en fluorescerende reporter-gen i forbindelse med et stort (150-200 kb) genomiske region ^31. Den fluorescerende reporter udtrykkes derefter i en Spatiotemporal mønster som bestemt af regulatoriske sekvenser i BAC. For studier i fisk, kan Tol2 sites føjes til BAC at lette genomisk integration ^32,33. I senere stadier af udvikling, når in situ hybridisering er teknisk udfordrende, kan det fluorescerende udlæsning af BAC bruges til at studere mønstre af genekspression, som det er blevet vist for hundestejle knoglemorfogenetisk protein 6 (BMP6) ^20. Derudover kan fluorescerende ekspressionsmønstre i et individ spores over tid, hvilket ikke kan opnås med in situ hybridisering. AKB kan også bruges til at tilføje en additional kopi af et genomisk region for at øge doseringen af ​​et gen af ​​interesse.

Til undersøgelse af genfunktion, genom redigering er en eksplosivt voksende område, der kan anvendes til fremstilling af målrettede ændringer genomiske sekvenser i en lang række organismer ^34. Transskriptionsaktivator-lignende effektor nukleaser (Talens) er modulopbyggede, sekvensspecifikke nukleaser oprindeligt isoleret fra plantepatogener, som kan netop manipuleret til at binde direkte til en genomisk sekvens af valg og generere en dobbeltstrengsbrud ^35,36. Grupperet regelmæssigt spatierede korte palindrome repeats (CRISPR) / CAS systemer blev oprindeligt fundet i bakterier og bruge en guide RNA og Cas9 proteinet for at generere en pause i en mål-DNA-sekvens komplementær til føringen ^37. Den efterfølgende reparation af dobbeltstrengsbrud skabt af både TALENS og CRISPRs ofte efterlader en lille insertion eller deletion, der kan forstyrre funktionen af ​​målsekvensen35-37. I hundestejler, er Talens blevet brugt til at afbryde genekspression ved at målrette en forstærker ^20, og begge Talens og CRISPRs har med succes produceret mutationer i kodning sekvenser (upublicerede data). En detaljeret protokol for generering af CRISPRs til brug i zebrafisk kan bruges som en rettesnor til at udvikle CRISPRs for hundestejler ^38.

Transgene og genom redigering eksperimenter kræver introduktion af nukleinsyrer i en nyligt befrugtet én-celle embryon. Ved at indføre transgen eller genom-redigeringsværktøj tidligt i udviklingen, er antallet af genetisk manipulerede datter celler i fosteret maksimeret. Injicerede embryoer derefter visuelt screenet for fluorescens eller molekylært screenet for genommodifikationer. Hvis celler, der bidrager til kønscellelinie succes er målrettet, kan transgenet eller mutation videregives til en delmængde af afkom, selv når efter injektion dødelighed er høj. De mosaik fisk kan udkrydsede ellerintercrossed og deres afkom screenet for at inddrive de mutant alleler eller et stabilt integreret transgen af ​​interesse. Denne protokol beskriver metoder til indførelse transgener og genom redigering reagenser i én-celle hundestejle embryoner og overvågning for vellykkede genomiske modifikationer.

Protocol

Alt fisk arbejde blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of California-Berkeley (protokol nummer R330). 1. Forbered nukleinsyrer til injektion Tol2 Plasmid Transgenese (Tilpasset fra Fisher 26). Skær 10 ug transposase plasmid (pcs-TP) 39 med 10 U NotI i medfølgende buffer i 1 time ved 37 ° C til linearisering. Bemærk: Materiale Transfer aftaler kan være nødvendigt for at opnå Tol2 plasmider. Ekstraher Skær plasmid…

Representative Results

For reportergenassays transgener der har enhanceraktivitet, vil succesfuld injektion resultere i specifik, cellulær ekspression af transgenet (figur 4A, 4C). Injicerede fisk kan derefter udkrydsede at producere stabile linjer (Eksempel på en BAC stabil linie vist i figur 4B). Injektion DNA i hundestejle embryoner typisk resulterer i langt højere dødelighed end RNA alene. Det er typisk at se op til 50% (nogle gange endda mere) letalit…

Discussion

Injektion én-celle hundestejle embryoner til transgenese eller genom redigering præsenterer tre hovedudfordringer. Første, i forhold til zebrafisk embryoner hundestejle embryonale chorion er hård og vil ofte bryde nåle. Dette problem kan delvis overvindes ved anvendelse tykkere og stærkere glas mikropipetter og injektion vinkelret chorion (se protokol, figur 2). Sikring af, at så lidt vand som muligt sættes til embryonerne (lige nok til at forårsage chorion at svulme op og løfte væk fra celle…

Materials

Stereomicroscope with transillumination	Leica	S6e/ KL300 LED
Manual micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MM33	Marzhauser M33 Micromanipulator
Pressure Injecion system	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3
Back pressure unit	Applied Scientific Instrumentation	BPU
Micropipette holder kit	Applied Scientific Instrumentation	MPIP
Magnetic base holder	Applied Scientific Instrumentation	Magnetic base
Foot switch	Applied Scientific Instrumentation	FSW
Iron plate (magnetic base)	Narishige	IP
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Disposable transfer pipettes	Fisher	13-711-7M
0.5% phenol red in DPBS	Sigma	P0290	injection tracer
#5 forceps, biologie dumoxel	Fine Science Tools	11252-30	for needle breaking
Micropipette Storage Jar	World Precision Instruments	E210	holds needles
6", 6 teeth per inch plaster drywall saw	Lenox	20571 (S636RP)	hold eggs for injection
13 cm x 13 cm glass plate	any hardware store	–
Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID	World Precision Instruments	1B100-F4	*harder glass than zebrafish injection capillaries
150 x 15mm petri dish	Fisher	FB0875714	raise stickleback embryos
35 x 10mm petri dish	Fisher	08-757-100A	store eggs pre-injection
Instant Ocean Salt	Instant Ocean	SS15-10
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761-500G
Tricaine methanesulfonate/MS-222	Western Chemical Inc	MS222	fish anaesthesia/euthanasia
Sp6 transcription kit	Ambion	AM1340	For transcription of TALENs and transposase mRNA
RNeasy cleanup kit	Qiagen	74104	purify transposase or TALEN RNA
QiaQuick PCR cleanup kit	Qiagen	28104	clean up plasmids for injection
Proteinase K 20 mg/ml	Ambion	AM2546	for DNA preparation
Nucleobond BAC 100 kit	Clontech	740579	for BAC DNA preparation
NotI	NEB	R0189L
Phusion polymerase	Fisher	F-530L
Qiagen PlasmidPlus Midi kit	Qiagen	12943	contains endotoxin rinse buffer
QIAQuick Gel Extraction	Qiagen	28704	for sequencing induced mutations
Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol	Sigma	P2069-100ML
Sodium acetate	Sigma	S2889-250G
Ethanol (molecular biology grade)	Sigma	E7023-500ML
Agarose	Sigma	A9539
50X Tris-acetate-EDTA buffer	ThermoFisher	B49
0.5-10KbRNA ladder	ThermoFisher	15623-200
Nanodrop  Spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Paraformaldehyde	Sigma	158127-500G
10X PBS	ThermoFisher	70011-044
1kb Plus DNA Ladder	ThermoFisher	10787-018
Potassium Chloride	Sigma	P9541-500G
Magnesium Chloride	Sigma	M8266-100G
NP-40	ThermoFisher	28324
Tween 20	Sigma	P1379-500ML
Tris pH 8.3	Teknova	T1083
12-strip PCR tube	Thermo Scientific	AB-1113