Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine
Summary
מניפולציות מהונדסות ועריכה הגנום הן קריטיים עבור תפקודית בדיקות התפקידים של גנים ואלמנטים רגולטורית cis. הנה פרוטוקול microinjection מפורט עבור הדור של שינויים גנומיים (כולל מבנים transgene כתב ניאון בתיווך Tol2, TALENs, ו CRISPRs) מוצג לגבי דגים המודל המתהווה, עוקצן threespine.
Abstract
דג עוקצן threespine התפתח כמערכת רבה עצמה כדי לחקור את הבסיס הגנטי של מגוון רחב של מורפולוגיים, פיסיולוגי, פנוטיפים התנהגותיים. פנוטיפים המגוונים להפליא שהתפתחו כמו אוכלוסיות ימיות להסתגל לסביבת מים מתוקה אינספור, בשילוב עם היכולת לחצות צורות ימיות מים מתוקים, לספק מערכת החולייתנים נדירה בם גנטיקה יכולה לשמש כדי למפות אזורי גנומית שליטה התפתחה תכונות. משאבי גנומי מצוינים זמינים כעת, הקלה לנתיחת גנטיקה מולקולרית של שינויים התפתחו. בעוד ניסויי מיפוי ביצירת רשימות של גני מועמדים מעניינים, מניפולציות גנטיות פונקציונליות נדרשות לבחון את התפקידים של גנים אלה. ויסות גנים ניתן ללמוד עם פלסמידים BACS כתב מהונדסים משולבים לתוך הגנום באמצעות מערכת transposase Tol2. פונקציות של גנים מועמדים ספציפיים ואלמנטים רגולטורית ציס ניתן להעריך על ידי גרימת ממוקדמוטציות עם Talen ו CRISPR / Cas9 ריאגנטים עריכת הגנום. כל השיטות דורשות החדרת חומצות גרעין לעוברי קוצן חד תא מופרה, משימה שנעשתה מאתגר ידי סיסי העבה של עוברת קוצן ואת blastomere הקטנה ורזה יחסית. כאן, פרוטוקול מפורט עבור microinjection של חומצות גרעין לעוברי קוצן מתואר ליישומים מהונדסים הגנום עריכה ללמוד ביטוי גנים ותפקוד, כמו גם טכניקות כדי להעריך את ההצלחה של transgenesis ולשחזר קווי יציבה.
Introduction
מרכיב בסיסי אחד של הבנה כיצד מגוון ביולוגי המתבקשת הוא לקביעת הבסיסי הגנטי והתפתחותיים של שינויים פנוטיפי התפתחו בטבע. דג עוקצן threespine, Gasterosteus aculeatus, התפתח מודל מצוין לחקר הבסיס הגנטי של אבולוציה. הקוצנים עברו שינויים אבולוציוניים אדפטיבית רבים כמו דגים ימיים יישבו בסביבות מים מתוקים אינספור ברחבי חצי הכדור הצפוני, וכתוצאה מכך מורפולוגיים דרמטי, פיזיולוגיים, ושינויים התנהגותיים 1. בגנום של אנשים מגובה של עשרים ואחד אוכלוסיות קוצן היה רצף והרכיבו, ומפה הצמדה צפיפות גבוהה נוצרה על מנת לשפר יותר את מכלול 2,3. ניסויי מיפוי גנטיים זיהו אזורים גנומית שבבסיס פנוטיפים התפתחו 4 – 6, ובעוד כמה מקרים, התפקידים התפקודיים של גני מועמדים ספציפיים נבדקו 7,8. מספר האזורים גנומית שבבסיס שינויים מורפולוגיים זוהה עם גני מועמדים מבטיחים, אך מועמדים אלו טרם נבדקו מבחינה תפקודית 9 – 12. בנוסף, הקוצנים הם מודלים נפוצים ללימודים של גנטיקה של אוכלוסיות / הגנומיקה 13,14, התפצלות 15, התנהגות 1, אנדוקרינולוגיה 16, ecotoxicology 17, אימונולוגיה 18 ופרזיטולוגיה 19. מחקרים עתידיים בכל אחד מהתחומים הללו ייהנו היכולת לבצע מניפולציות גנטיות תפקודיות הקוצנים. בנוסף מניפולצית רצפי הקידוד שלהם, את התפקידים של גני מועמדים ניתן להעריך על ידי לימוד הרצפים רגולטורית ציס שלהם ועל ידי הגדלה מבחינה תפקודית, קטן, או ביטול הביטוי של גן המועמד. שיטות Microinjection ו transgenesis ב הקוצנים מבוססות היטב 7,8,20 ו בתחילה פותחו באמצעות meganuclease בתיווךשיטה 21 תוארה לראשונה בשנת medaka 22. שיטת microinjection השונה המוצגת כאן כבר אופטימיזציה עבור שניהם transgenesis Tol2 בתיווך ופתחה לאחרונה ריאגנטים עריכת הגנום כולל TALENs ו CRISPRs.
שינויי האלמנטים רגולטורית ציס נחשבים קריטי לאבולוציה מורפולוגיים, כמו השינויים רגולטורית ציס יכולים למנוע את ההשלכות השליליות של pleiotropic קידוד מוטציות 23. לכן, בדיקה והשוואת רצפים רגולטורית ציס משוערים הפכה ליעד מרכזי של מספר גדל והולך של מחקרים אבולוציוניים. בנוסף, רוב גרסאות מחלות אנושיות הן גרסאות רגולטוריות 24,25, ומערכות חוליות מודל נדרשים עז ללמוד לתפקד אלמנט רגולטורית ציס וההיגיון. דגים כי לדשן העוברי שלהם כלפי חוץ במספרים גדולים להציע מערכות חוליות רבות עצמה כדי לחקור -regulation cis. מערכת transposon Tol2, שבו foreiDNA GN להיות משולבת בגנום מוקף Tol2 transposase אתרי קישור ושיתוף הזריקו Tol2 transposase mRNA, עובד עם יעילות גבוהה לשילוב בהצלחה פלסמיד בונה לתוך הגנום דגים 26 – 28. בדרך כלל, משפר הפוטנציאל הוא משובטים במעלה הזרם של האמרגן הבזליים (כגון hsp70l 29) ואת הגן כתב ניאון כגון EGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת) או mCherry בתוך עמוד השדרה Tol2 והזריקו עם transposase mRNA 26. תצפית ביטוי של כתב הניאון, בין אם עובר מוזרקים או צאצא עם transgenes משולב ביציבות, מספקת מידע על ויסות spatiotemporal של ביטוי גנים מונעת על ידי המשפר המשוער. בניסויים נוספים, משפרי תוקף ניתן להשתמש בכונן ביטוי יתר ספציפי רקמות של גנים של עניין.
באשר לניתוח אזורי רגולטורית ציס גדולים, באיכות גבוהה genom בקנה הכנסic ספריות באמצעות כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי (BACS) נבנו עבור שני הקוצנים ימיים מים מתוקים 30. Bács אלה ניתן recombineered להחליף גן עם גן כתב ניאון בהקשר של (kb 150-200) גדול באזור הגנומי 31. כתב הניאון מתבטא אז דפוס spatiotemporal כפי שנקבע על ידי רצפי רגולציה בתוך BAC. עבור מחקרים בדגים, אתרי Tol2 ניתן להוסיף גם את BAC כדי להקל אינטגרציה הגנומי 32,33. בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות כאשר הכלאה באתרו הוא מאתגר מבחינה טכנית, את ההודעה הניאון של BAC יכול לשמש כדי לחקור דפוסי ביטוי גנים, כפי שהוכח לחלבון קוצן עצם המוךפו"גנטי שהולך 6 (Bmp6) 20. בנוסף, דפוסי ביטוי ניאון אדם יכול להיות במעקב לאורך זמן, אשר לא יכול להיות מושלם עם הכלאה באתרה. Bács יכול לשמש גם כדי להוסיף additionaעותק l של אזור גנומי כדי להגדיל את המינון של גן של עניין.
לצורך המחקר של תפקוד הגן, עריכת הגנום הוא השדה המתרחב בפיצוץ, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר שינויים ממוקדים אל רצפי הגנום במגוון רחב של אורגניזמים 34. מפעיל דמוי תמלול nucleases מפעיל (TALENs) הם nucleases מודולרי, ספציפית רצף מבודד במקור פתוגנים צמח יכול להיות מהונדסים בדיוק להיקשר ישירות רצף גנומי של בחירה וליצור גדיל כפול לשבור 35,36. באשכולות בקביעות interspaced חזרות palindromic קצר (CRISPR) / מערכות CAS נמצאו במקור חיידקים להשתמש RNA מדריך ואת החלבון Cas9 כדי ליצור הפסקה ברצף ה- DNA היעד משלים מדריך 37. התיקון בדיעבד של הפסקת הגדיל הכפולה שיצרה שתי TALENs ו CRISPRs לעתים קרובות משאיר אחריו כניסה קטנה או מחיקה, אשר יכול לשבש את הפונקציה של רצף היעד35-37. בשנת הקוצנים, שימשו TALENs לשבש ביטוי גנים על ידי מיקוד משפר 20, ושניהם TALENs ו CRISPRs יצרו בהצלחה מוטציות קידוד רצפים (נתונים שלא פורסמו). פרוטוקול מפורט עבור הדור של CRISPRs לשימוש דג הזברה יכול לשמש כקו מנחה לפתח CRISPRs עבור הקוצנים 38.
מהונדס וניסויי עריכת הגנום דורשים מבוא של חומצות גרעין לתוך עובר חד-תאי שהופרה זה עתה. על ידי הצגת כלי transgene או הגנום עריכת בשלב מוקדם של התפתחות, מספר תאי הבת מניפולציות גנטיות בעובר מוגדל. עובר מוזרק אז מוקרנים חזותיים עבור קרינה או הוקרנתי מולקולרי עבור שינויים בגנום. אם תאי תורם germline ממוקדים בהצלחה, את הגן או המוטציה יכול להיות עברה על קבוצת משנה של צאצאים, גם כאשר הקטלניות לאחר הזרקה היא גבוהות. דג הפסיפס ניתן outcrossed אוintercrossed וצאצאיהם הוקרנו לשחזר את אללים מוטנטים או transgene משולב ביציבות של ריבית. פרוטוקול זה מתאר שיטות להכנסת transgenes ריאגנטים עריכת הגנום לעוברי קוצן חד-תאים וניטור עבור שינויים גנומיים מוצלחים.
Protocol
Representative Results
Discussion
חד-תאי הזרקה עוברת קוצן עבור transgenesis או עריכת הגנום מציג שלושה אתגרים מרכזיים. ראשית, ביחס עוברי דג זברה, הסיסי עוברי קוצן קשה ולעתים קרובות ישבור מחטים. בעיה זו ניתן להתגבר חלקית על ידי שימוש micropipettes זכוכית עבה וחזק וההזרקה בניצב הסיסי (ראה פרוטוקול, איור 2). הה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה בחלקה על ידי NIH R01 # DE021475 (CTM), גידול NIH Predoctoral הדרכה גרנט 5T32GM007127 (PAE), וכן מלגת מחקר לתארים מתקדמים NSF (NAE). אנו מודים קווין Schwalbach לביצוע BAC recombineering וזריקות, ניק Donde להפקת הנתונים רצף CRISPR סנגר, וקתרין ליפארי עבור משוב מועיל על פרוטוקול ההזרקה.
Materials
| Stereomicroscope with transillumination | Leica | S6e/ KL300 LED | |
| Manual micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | Marzhauser M33 Micromanipulator |
| Pressure Injecion system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Magnetic base holder | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic base | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Iron plate (magnetic base) | Narishige | IP | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Disposable transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| 0.5% phenol red in DPBS | Sigma | P0290 | injection tracer |
| #5 forceps, biologie dumoxel | Fine Science Tools | 11252-30 | for needle breaking |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | holds needles |
| 6", 6 teeth per inch plaster drywall saw | Lenox | 20571 (S636RP) | hold eggs for injection |
| 13 cm x 13 cm glass plate | any hardware store | – | |
| Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100-F4 | *harder glass than zebrafish injection capillaries |
| 150 x 15mm petri dish | Fisher | FB0875714 | raise stickleback embryos |
| 35 x 10mm petri dish | Fisher | 08-757-100A | store eggs pre-injection |
| Instant Ocean Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Tricaine methanesulfonate/MS-222 | Western Chemical Inc | MS222 | fish anaesthesia/euthanasia |
| Sp6 transcription kit | Ambion | AM1340 | For transcription of TALENs and transposase mRNA |
| RNeasy cleanup kit | Qiagen | 74104 | purify transposase or TALEN RNA |
| QiaQuick PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | clean up plasmids for injection |
| Proteinase K 20 mg/ml | Ambion | AM2546 | for DNA preparation |
| Nucleobond BAC 100 kit | Clontech | 740579 | for BAC DNA preparation |
| NotI | NEB | R0189L | |
| Phusion polymerase | Fisher | F-530L | |
| Qiagen PlasmidPlus Midi kit | Qiagen | 12943 | contains endotoxin rinse buffer |
| QIAQuick Gel Extraction | Qiagen | 28704 | for sequencing induced mutations |
| Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol | Sigma | P2069-100ML | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889-250G | |
| Ethanol (molecular biology grade) | Sigma | E7023-500ML | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| 50X Tris-acetate-EDTA buffer | ThermoFisher | B49 | |
| 0.5-10KbRNA ladder | ThermoFisher | 15623-200 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500G | |
| 10X PBS | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1kb Plus DNA Ladder | ThermoFisher | 10787-018 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541-500G | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266-100G | |
| NP-40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ML | |
| Tris pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| 12-strip PCR tube | Thermo Scientific | AB-1113 |
References
- Bell, M. A., Foster, S. A. . The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , (1994).
- Jones, F. C., et al. The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks. Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).
- Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).
- Miller, C. T., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci. Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).
- Shapiro, M. D., et al. Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks. Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).
- Colosimo, P. F., et al. Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles. Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).
- Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
- O’Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA. eLife. , e05290 (2015).
- Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
- Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822 (2014).
- Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. EvoDevo. 5 (1), (2014).
- Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. 142, 2442-2451 (2015).
- Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).
- Hohenlohe, P. A., et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags. PLoS Genet. 6 (2), e1000862 (2010).
- McKinnon, J. S., Rundle, H. D. Speciation in nature: the threespine stickleback model systems. Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).
- Shao, Y. T., et al. Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).
- Katsiadaki, I., et al. Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption. Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).
- Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis. Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).
- Barber, I. Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology. Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).
- Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
- Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Carroll, S. B. Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134 (1), 25-36 (2008).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
- Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
- Fisher, S., et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kikuta, H., Kawakami, K. Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors. Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).
- Kingsley, D. M., et al. New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).
- Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene. Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice. BMC Genomics. 10 (1), 477 (2009).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
- Kawakami, K., et al. A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning a laboratory manual. , (2012).
- Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish. Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).
- Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).
- Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) . , (2007).
- Dale, R. M., Topczewski, J. Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a. Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
