Summary

Microiniezione per Transgenesi e Genome Editing in Threespine spinarelli

Published: May 13, 2016
doi:

Summary

Manipolazioni transgeniche e la modifica del genoma sono fondamentali per il collaudo funzionale i ruoli dei geni ed elementi -regulatory cis. Ecco una dettagliata protocollo microiniezione per la generazione di modifiche genomiche (compresi costrutti Tol2-mediate fluorescenti giornalista transgene, Talens, e CRISPRs) è presentato per il pesce modello emergente, il Spinarello.

Abstract

Il pesce Spinarello è emersa come un potente sistema per studiare la base genetica di una vasta gamma di morfologica, fisiologica, e fenotipi comportamentali. I fenotipi notevolmente diverse che si sono evoluti come le popolazioni marine si adattano agli ambienti di acqua dolce innumerevoli, combinata con la capacità di attraversare le forme marine e d'acqua dolce, forniscono un sistema di vertebrati raro in cui la genetica può essere utilizzato per mappare regioni genomiche il controllo sia evoluto tratti. Eccellenti risorse genomiche sono ora disponibili, facilitando molecolare dissezione genetica dei cambiamenti evoluti. Mentre gli esperimenti di mappatura generano liste di geni candidati interessanti, manipolazioni genetiche funzionali sono necessari per testare il ruolo di questi geni. regolazione genica può essere studiato con plasmidi reporter transgenici e BAC integrate nel genoma utilizzando il sistema trasposasi Tol2. Funzioni di specifici geni candidati e gli elementi -regulatory cis possono essere valutate inducendo miratamutazioni con Talen e CRISPR / Cas9 reagenti modifica del genoma. Tutti i metodi richiedono l'introduzione di acidi nucleici in fecondate embrioni spinarello un cellulare, un compito reso difficile dalla fitta corion di embrioni stickleback e il relativamente piccolo e sottile blastomeri. Qui, un protocollo dettagliato per la microiniezione di acidi nucleici in embrioni spinarello è descritto per le applicazioni transgeniche e la modifica del genoma per studiare l'espressione genica e la funzione, così come le tecniche per valutare il successo di transgenesi e recuperare le linee stabili.

Introduction

Una componente fondamentale di capire come la biodiversità si pone è la determinazione delle basi genetiche e di sviluppo dei cambiamenti fenotipici evoluti in natura. Il pesce Spinarello, Gasterosteus aculeatus, è emerso come un ottimo modello per studiare le basi genetiche dell'evoluzione. Spinarelli hanno subito molti cambiamenti evolutivi adattativi come i pesci marini hanno colonizzato gli ambienti di acqua dolce innumerevoli intorno nell'emisfero settentrionale, con conseguente morfologica drammatico, fisiologici, e cambiamenti comportamentali 1. I genomi di individui di ventuno popolazioni stickleback sono stati sequenziati e assemblati, e una mappa linkage alta densità è stato generato per migliorare ulteriormente il gruppo 2,3. Esperimenti di mappatura genetici hanno identificato regioni genomiche sottostante fenotipi evoluti 4 6, e in alcuni casi, i ruoli funzionali di geni specifici sono stati testati 7,8. Un certo numero di regioni genomiche sottostanti cambiamenti morfologici sono stati identificati con promettenti geni candidati, ma questi candidati non sono ancora stati testati funzionalmente 9 12. Inoltre, spinarelli sono modelli comuni per gli studi di genetica delle popolazioni / genomica 13,14, speciazione 15, il comportamento 1, endocrinologia 16, ecotossicologia 17, l'immunologia 18 e parassitologia 19. Futuri studi in ciascuno di questi settori beneficeranno della possibilità di eseguire manipolazioni genetiche funzionali in spinarelli. Oltre a manipolare le sequenze codificanti, i ruoli dei geni candidati possono essere valutate studiando le loro sequenze -regulatory cis e funzionalmente crescente, decrescente o eliminando espressione del gene candidato. Microiniezione e transgenesi metodi in spinarelli sono ben stabiliti 7,8,20 e sono stati inizialmente sviluppati utilizzando un meganuclease-mediataMetodo 21 descritto per primo nel Medaka 22. Il metodo microiniezione modificato presentato qui è stato ottimizzato sia per la transgenesi Tol2-mediata e recentemente sviluppato reagenti di modifica del genoma tra Talens e CRISPRs.

Modifiche a cis -regulatory elementi sono pensati per essere critico per l'evoluzione morfologica, come cis -regulatory cambiamenti possono evitare le conseguenze negative pleiotropici di codifica mutazioni 23. Pertanto, prova e il confronto putative sequenze -regulatory cis è diventato un obiettivo centrale di un numero crescente di studi evolutivi. Inoltre, la maggior parte delle varianti di malattie umane sono varianti normative 24,25 e sistemi modello vertebrati sono dolorosamente necessari per studiare cis Funzione di un elemento -regulatory e la logica. I pesci che fertilizzare i loro embrioni esternamente in gran numero offrono potenti sistemi di vertebrati a studiare -Regolamento cis. Il sistema di trasposoni Tol2, in cui commDNA gn per essere integrato nel genoma è fiancheggiato da Tol2 trasposasi siti di legame e di co-iniettato con Tol2 trasposasi mRNA, funziona con alta efficienza per l'integrazione con successo plasmide costruisce sui genomi di pesce 26 28. In genere, un potenziale Enhancer è clonato a monte di un promotore basale (come hsp70l 29) e del gene reporter fluorescente come EGFP (enhanced green fluorescent protein) o mCherry in una spina dorsale Tol2 e iniettato con trasposasi mRNA 26. L'osservazione di espressione del reporter fluorescente, sia in embrioni o discendenti con transgeni stabilmente integrati iniettati, fornisce informazioni sulla regolazione spazio-temporale dell'espressione genica guidato dal enhancer putativo. In ulteriori esperimenti, esaltatori validati possono essere utilizzati per guidare sovraespressione tessuto-specifica dei geni di interesse.

Per l'analisi delle più grandi regioni -regulatory cis, di alta qualità genom grande insertolibrerie IC utilizzando cromosomi batterici artificiali (BAC) sono stati costruiti per entrambe le marine e di acqua dolce spinarelli 30. Questi BAC possono essere recombineered per sostituire un gene con un gene reporter fluorescente nel contesto di un grande (150-200 kb) regione genomica 31. Il reporter fluorescente viene poi espressa in un modello spazio-temporale, come determinato dal sequenze regolatrici all'interno del BAC. Per gli studi nei pesci, siti Tol2 possono essere aggiunti alla BAC per facilitare genomico integrazione 32,33. Nelle fasi successive di sviluppo, quando l'ibridazione in situ è tecnicamente impegnativo, la lettura fluorescenza del BAC può essere utilizzato per studiare gli schemi di espressione genica, come è stato dimostrato per stickleback proteina morfogenetica 6 (BMP6) 20. Inoltre, i modelli di espressione fluorescenti in un individuo possono essere monitorati nel corso del tempo, che non può essere realizzato con l'ibridazione in situ. BAC può essere utilizzato anche per aggiungere un additional copia di una regione genomica di aumentare il dosaggio di un gene di interesse.

Per lo studio della funzione del gene, editing genoma è un campo esplosivo espansione che può essere utilizzato per produrre cambiamenti mirati a sequenze genomiche in un'ampia varietà di organismi 34. Trascrizione attivatore-come nucleasi effettrici (Talens) sono, nucleasi modulari sequenza-specifiche originariamente isolato da agenti patogeni delle piante che possono essere progettati proprio per legarsi direttamente ad una sequenza genomica di scelta e di generare un doppio filamento pausa 35,36. Cluster regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / sistemi CAS sono stati originariamente trovati nei batteri e utilizzare un RNA guida e la proteina Cas9 per generare una pausa in una sequenza di DNA bersaglio complementare alla guida 37. La successiva riparazione della rottura a doppio filamento creato da entrambe le Talens e CRISPRs spesso lascia dietro di sé una piccola inserimento o la cancellazione, che possono interferire con la funzione della sequenza bersaglio35-37. In spinarelli, Talens sono stati utilizzati per distruggere l'espressione genica di mira un potenziatore 20, ed entrambi Talens e CRISPRs hanno prodotto con successo le mutazioni in sequenze codificanti (dati non pubblicati). Un protocollo dettagliato per la generazione di CRISPRs per l'utilizzo in zebrafish può essere utilizzato come linea guida per sviluppare CRISPRs per spinarelli 38.

esperimenti di modifica transgenici e genoma richiedono l'introduzione di acidi nucleici in un appena fecondato embrione unicellulare. Con l'introduzione del transgene strumento o del genoma di modifica nelle prime fasi di sviluppo, il numero di cellule figlie geneticamente manipolate in l'embrione è massimizzata. embrioni iniettati vengono poi proiettati visivamente per fluorescenza o molecolarmente sottoposti a screening per le modifiche del genoma. Se le cellule che contribuiscono alla linea germinale sono mirati con successo, il transgene o mutazioni possono essere trasmessi a un sottoinsieme di prole, anche quando post-iniezione letale è elevata. Il pesce a mosaico possono essere outcrossed oincrocia e la loro prole proiettato per recuperare i alleli mutanti o un transgene stabilmente integrata di interesse. Questo protocollo descrive i metodi per l'introduzione di transgeni e l'editing di reagenti genoma in embrioni spinarello uno-cellula e di monitoraggio per le modifiche genomiche di successo.

Protocol

Tutti i lavori di pesce è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali e l'uso della University of California-Berkeley (numero di protocollo R330). 1. Preparare acidi nucleici per iniezione Tol2 plasmidi Transgenesi (Adattato da Fisher 26). Tagliare 10 mcg trasposasi plasmide (PCS-TP) 39 con 10 U Noti nel buffer fornito per 1 ora a 37 ° C per la linearizzazione. Nota: Gli accordi materiale di trasferimento può essere richiesto per ottenere …

Representative Results

Per transgeni Reporter gene che hanno attività enhancer, iniezione di successo si tradurrà in specifico, espressione cellulare del transgene (Figura 4A, 4C). Pesci iniettati possono essere outcrossed per produrre linee stabili (esempio di una linea stabile BAC mostrato nella Figura 4B). L'iniezione di DNA in embrioni stickleback in genere si traduce in letalità di gran lunga superiore rispetto alla sola RNA. È tipico vedere fino …

Discussion

Iniettano embrioni stickleback una cella per transgenesi o la modifica del genoma presenta tre sfide principali. In primo luogo, relativamente agli embrioni di zebrafish, lo spinarello embrionali corion è dura e spesso rompere gli aghi. Questo problema può essere superato parzialmente usando micropipette di vetro più spesse e più forti e iniettando perpendicolare al corion (vedi protocollo, figura 2). Assicurare che il meno acqua possibile si aggiunge agli embrioni (quanto basta per causare il corio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato in parte dal NIH R01 # DE021475 (CTM), un NIH predoctoral formazione di Grant 5T32GM007127 (PAE), e un Graduate Research Fellowship NSF (NAE). Ringraziamo Kevin Schwalbach per l'esecuzione di BAC recombineering e iniezioni, Nick Donde per la generazione di dati di sequenziamento Sanger CRISPR, e Katherine Lipari per il feedback utile sul protocollo di iniezione.

Materials

Stereomicroscope with transillumination Leica S6e/ KL300 LED
Manual micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33 Marzhauser M33 Micromanipulator
Pressure Injecion system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Magnetic base holder Applied Scientific Instrumentation Magnetic base
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Iron plate (magnetic base) Narishige IP
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97
Disposable transfer pipettes Fisher 13-711-7M
0.5% phenol red in DPBS Sigma  P0290 injection tracer
#5 forceps, biologie dumoxel  Fine Science Tools 11252-30 for needle breaking
Micropipette Storage Jar World Precision Instruments E210 holds needles
6", 6 teeth per inch plaster drywall saw Lenox 20571 (S636RP) hold eggs for injection
13 cm x 13 cm glass plate any hardware store
Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID  World Precision Instruments 1B100-F4 *harder glass than zebrafish injection capillaries
150 x 15mm petri dish Fisher FB0875714 raise stickleback embryos
35 x 10mm petri dish Fisher 08-757-100A store eggs pre-injection
Instant Ocean Salt Instant Ocean SS15-10
Sodium Bicarbonate Sigma S5761-500G
Tricaine methanesulfonate/MS-222 Western Chemical Inc MS222 fish anaesthesia/euthanasia
Sp6 transcription kit Ambion AM1340 For transcription of TALENs and transposase mRNA
RNeasy cleanup kit Qiagen 74104 purify transposase or TALEN RNA
QiaQuick PCR cleanup kit Qiagen 28104 clean up plasmids for injection
Proteinase K 20 mg/ml Ambion AM2546 for DNA preparation
Nucleobond BAC 100 kit Clontech 740579 for BAC DNA preparation
NotI NEB R0189L
Phusion polymerase Fisher F-530L
Qiagen PlasmidPlus Midi kit Qiagen 12943 contains endotoxin rinse buffer
QIAQuick Gel Extraction Qiagen 28704  for sequencing induced mutations
Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol Sigma P2069-100ML
Sodium acetate Sigma S2889-250G
Ethanol (molecular biology grade) Sigma E7023-500ML
Agarose Sigma A9539
50X Tris-acetate-EDTA buffer ThermoFisher B49
0.5-10KbRNA ladder ThermoFisher 15623-200
Nanodrop  Spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 2000
Paraformaldehyde Sigma 158127-500G
10X PBS ThermoFisher 70011-044
1kb Plus DNA Ladder ThermoFisher 10787-018
Potassium Chloride Sigma P9541-500G
Magnesium Chloride Sigma M8266-100G
NP-40 ThermoFisher 28324
Tween 20 Sigma P1379-500ML
Tris pH 8.3 Teknova T1083
12-strip PCR tube Thermo Scientific AB-1113

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Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055, doi:10.3791/54055 (2016).

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