Summary

Threespine Sticklebacks içinde Transgenesis ve Genom Kurgu Mikroenjeksiyon

Published: May 13, 2016
doi:

Summary

Transgenik manipülasyonlar ve genom düzenleme işlevsel genler ve sis -regulatory unsurların rollerini test etmek için kritik öneme sahiptir. Burada (Tol2 aracılı flüoresan raportör transgen yapıları, Talens ve CRISPRs dahil) genomik değişiklik üretimi için ayrıntılı bir mikroenjeksiyon protokolü acil modeli balık, threespine dikenli balıkgil sunulmuştur.

Abstract

threespine dikenli balık morfolojik, fizyolojik çeşitli genetik temelini incelemek için güçlü sistemi ve davranışsal fenotipleri olarak ortaya çıkmıştır. deniz ve tatlı su formlarını geçmeye yeteneği ile kombine deniz popülasyonları sayısız tatlı su ortamlarına adapte olarak geliştiğini oldukça farklı fenotipleri, genetik özellikleri gelişti kontrol edilmesi genomik bölgeleri eşleştirmek için kullanılabilecek nadir bir omurgalı sistem sağlar. Mükemmel genomik kaynakları gelişti değişikliklerin moleküler genetik diseksiyon kolaylaştırılması, artık mevcuttur. haritalama deneyleri ilginç aday genlerin listeleri oluşturmak iken, fonksiyonel genetik manipülasyonlar bu genlerin rolleri test etmek için gereklidir. Gen düzenlemesi Tol2 transposaz sistemi kullanılarak genomuna entegre transgenik raportör plazmid ve BACler ile incelenebilir. Belirli aday genler ve sis -regulatory elemanların fonksiyonları hedeflenen indükleyerek değerlendirilebilirTALEN ve CRISPR / Cas9 genom düzenleme reaktifleri ile mutasyonları. Tüm yöntemler, döllenmiş tek hücre dikenli embriyolar nükleik asitleri ilave gerektirir, bir görev dikenli embriyo kalın koryon ve nispeten küçük ve ince blastomere ile zor oldu. Burada, dikenli embriyolar nükleik asitlerin mikroenjeksiyon için ayrıntılı bir protokol transgenik ve genom düzenleme gen ekspresyonu ve fonksiyon çalışma uygulamaları yanı sıra, transgenesis başarısını değerlendirme ve kararlı çizgiler kurtarmak için teknikler tarif edilmiştir.

Introduction

biyoçeşitlilik doğada evrimleşmiş fenotipik değişikliklerin genetik ve gelişimsel üsleri belirlemektir nasıl ortaya çıktığını anlamak biri temel bileşeni. Threespine dikenli balık, Gasterosteus aculeatus evrim genetik temeli çalışmak için mükemmel bir model olarak ortaya çıkmıştır. Sticklebacks deniz balıkları kuzey yarımkürede etrafında sayısız tatlı su ortamları kolonize gibi dramatik morfolojik, fizyolojik sonuçlanan birçok adaptif evrimsel değişikliklere uğramıştır, ve var davranış değişiklikleri 1. Yirmi bir dikenli popülasyonlardan bireylerin genomları dizilenmiş ve birleştirilmiş ve yüksek yoğunluklu bir bağlantı harita daha düzeneğinin 2,3 geliştirmek için oluşturulduktan edilmiştir. Genetik haritalama deneyleri gelişti fenotipler, bazan 4 yatan genomik bölgeleri belirledik 6 ve bazı durumlarda, belirli aday genlerin fonksiyonel rolleri 7,8 sınanmıştır. Morfolojik değişikliklerin altında yatan genomik bölgelerin bir dizi vaat aday genler ile tespit edilmiştir, ancak bu adaylar henüz işlevsel 9 test edilmemiştir 12. Buna ek olarak, Sticklebacks populasyon genetiği / genomik 13,14, türleşme 15, davranış 1, endokrinoloji 16, ekotoksikoloji 17, immünoloji 18 ve Parazitoloji 19 çalışmaları için ortak modellerdir. Bu alanların her birinde gelecek çalışmalar Sticklebacks fonksiyonel genetik manipülasyonlar yapmak için yetenek yararlanacaktır. Kendi kodlama dizileri manipüle ek olarak, bir aday genin rol cis -regulatory dizileri inceleyerek ve fonksiyonel olarak arttırmak, azaltmak ya da aday genin ifadesinin elimine ile değerlendirilebilir. Sticklebacks Mikroenjeksiyon ve transgenezi yöntemleri iyi 7,8,20 oluşturulmuş ve ilk kullanılarak geliştirilmiştir bir meganuclease aracılıyöntem, 21, birinci Medaka 22'de tarif. Burada yer alan değiştirilmiş mikroenjeksiyon yöntemi hem Tol2 aracılı genetik dönüştürme için optimize edilmiş ve en son TALENS ve CRISPRs içeren genom düzenleme reaktifleri geliştirilmiştir.

Cis -regulatory elemanlara değişiklikler cis -regulatory değişiklikler mutasyonlar 23 kodlama olumsuz pleiotropik sonuçları önlemek gibi, morfolojik evrimi kritik olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle, varsayılan sis -regulatory dizileri test ve karşılaştırma evrim çalışmalarında artan sayıda merkezi hedefi haline gelmiştir. Buna ek olarak, çoğu insan hastalık varyantları şiddetle sis -regulatory eleman fonksiyonu ve mantık incelemek için gerekli olan düzenleyici varyantları 24,25 ve model omurgalı sistemleridir. Çok sayıda dışarıdan kendi embriyolar aşılamak balık sis -Yönetmeliği incelemek için güçlü omurgalı sistemleri sunuyoruz. forei burada Tol2 transpozon sistemi,genomuna entegre edilecek gn DNA Tol2 transposase siteleri ve bağlayıcı ile çevrili, Tol2 transposase mRNA ile işbirliği enjekte başarıyla plazmid balık genomları 26 içine yapıları entegre etmek için yüksek verimlilik ile çalışır 28. Tipik olarak, potansiyel bir güçlendirici, bir Tol2 omurgada bir (örneğin hsp70l 29 gibi), bazal promotör ve flüoresan raportör gen gibi EGFP gibi (gelişmiş yeşil floresan protein) ya da mCherry akım-yukan klonlandı transposaz mRNA 26 enjekte edilir. floresan muhabiri, ya enjekte edilen embriyoların veya stabil entegre transgenlerin ile yavrularda ifade Gözlem, farazi arttırıcı tarafından yönlendirilen gen ifadesinin zamanmekansal yönetmelik hakkında bilgi sağlar. Diğer deneylerde de, geçerliliği arttırıcı ilgi genlerinin dokuya özel aşırı ekspresyonu tahrik etmek için kullanılabilir.

Büyük sis -regulatory bölgelerin analizi, yüksek kalite geniş insert genomunabakteriyel yapay kromozom (BAC) ile ic kütüphaneleri hem deniz ve tatlı su Sticklebacks 30 inşa edilmiştir. Bu BAC'ler büyük (150-200 kb) bağlamında bir flüoresan raportör geninin genomik bölge 31, bir gen yerine recombineered edilebilir. BAC olan düzenleyici diziler tarafından belirlenen flüoresan raportör sonra uzaysal model olarak ifade edilir. Balık çalışmaları için, Tol2 siteleri genomik entegrasyon 32,33 kolaylaştırmak için BAC eklenebilir. Gelişiminin sonraki evrelerinde in situ hibridizasyon teknik açıdan zor olarak, BAC floresan okuyucu dikenli kemik morfogenetik protein 6 (Bmp6) 20 için gösterildiği gibi, gen ekspresyonu örüntüleri incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, bir bireyde, floresan ekspresyon modelleri, in situ hibridizasyon ile başarılı olamaz zaman üzerinde takip edilebilir. BAC'ler, aynı zamanda bir additiona eklemek için kullanılabilirbir genomik bölgenin L kopya ilgi konusu bir genin dozajı artırmak.

Gen fonksiyonunun çalışması için, genom düzenleme organizmaların 34 çeşitli genomik dizileri hedef alan değişiklikleri oluşturmak için kullanılabilecek bir patlayıcı genişleyen bir alandır. Transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (TALENS) ilk olarak tam olarak tercih edilen bir genomik sekansa doğrudan bağlanan ve bir çift şerit 35,36 kırmak oluşturmak için tasarlanmış olabilir bitki patojenleri izole modüler, sekansa özel nükleazlar bulunmaktadır. Kümelenmiş düzenli aralıklarla yerleştirilmişlerdir kısa yineleyen tekrarlar (CRISPR) / CAS sistemleri ilk bakterilerde bulunan ve kılavuzun 37 tamamlayıcı bir hedef DNA dizisinin bir ara oluşturmak için bir kılavuz RNA ve Cas9 proteini kullanmak edildi. genellikle TALENS ve CRISPRs ile oluşturulan çift iplik kırılım onarımı sonraki hedef sekansın fonksiyonunu bozabilir küçük ekleme veya delesyon, geride bırakır35-37. Sticklebacks olarak, TALENS bir takviye 20 hedef gen ekspresyonunu bölmek için kullanılmaktadır ve TALENS ve CRISPRs iki başarılı dizileri (yayınlanmamış veriler) kodlayan mutasyonlar üretmişlerdir. Zebrabalıkları kullanılmak için CRISPRs üretimi için ayrıntılı bir protokol Sticklebacks 38 için CRISPRs geliştirmek için bir kılavuz olarak kullanılabilir.

Transjenik ve genom düzenleme deneyleri yeni döllenmiş tek hücre embriyoya nükleik asitlerin giriş gerektirir. erken gelişim transgen ya da genom-düzenleme aracı tanıştırarak, embriyo genetik manipüle kızı hücrelerin sayısı maksimize edilir. Enjekte embriyolar daha sonra görsel floresan için tarama ya da moleküler genom değişiklikleri için taranmaktadır. germline katkıda hücreler başarıyla hedef ise, transgen veya mutasyon enjeksiyon sonrası öldürücülüğü yüksek olsa bile, yavru bir alt kümesine geçebilir. mozaik balık outcrossed olabilir veyaintercrossed ve onların yavrularının mutant allel ya da ilgi kararlı biçimde entegre edilmiş transgen kurtarmak için gösterildi. Bu protokol, tek hücreli dikenli embriyolar transgenlerin ve genom düzenleme maddeleri eklemek ve başarılı genomik değişiklik izlenmesi için yöntemler tarif etmektedir.

Protocol

Tüm balık çalışmaları California-Berkeley Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (protokol numarası R330) tarafından onaylandı. 1. Enjeksiyon için Nükleik Asit hazırlayın (Fisher 26 den uyarlanmıştır) Tol2 Plazmid Transgenesis. Linearize 37 ° C'de 1 saat boyunca birlikte verilen tampon maddesi içinde 10 ug transposaz plazmid (PCS-Tp), 10 U Notl ile 39 kesilir. Not: Malzeme Aktarım Anlaşmaları Tol2 plazmidler elde etmek …

Representative Results

Güçlendirici etkiye sahip raportör gen transgenlerin için, başarılı bir enjeksiyon transgeni (Şekil 4A, 4C) spesifik hücresel ifadesi ile sonuçlanır. Enjekte balıklar sonra kararlı çizgiler (Şekil 4B'de gösterilen bir BAC stabil hattı örneği) üretilmesi için çaprazlanırlar edilebilir. dikenli embriyolara DNA enjekte tipik olarak tek başına RNA çok daha yüksek öldürücülüğü sonuçlanır. Bu% 50'ye …

Discussion

transgenesis ya da genom düzenleme için enjekte tek hücreli dikenli embriyolar üç ana zorluklar getirmektedir. İlk olarak, Zebra balığı embriyolarının göre, dikenli embriyonik koryon sert ve sık sık iğne kıracak. Bu sorun kısmen kalın ve güçlü cam mikropipetler kullanarak ve koryon dik enjekte edilerek aşılabilir (Protokolü, bakınız Şekil 2). Mümkün olduğunca az su sağlanması embriyoların eklenir (yeterli koryon şişer ve uzak hücreden kaldırmak için neden) koryon se…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH R01 # DE021475 (CTM), NIH predoctoral Eğitim Hibe 5T32GM007127 (PAE), ve bir NSF Yüksek Lisans Araştırma Bursu (NAE) tarafından kısmen finanse edildi. Biz enjeksiyon protokolüne yararlı geribildirim için CRISPR Sanger sıralama verilerinin üretilmesi için BAC Recombineering ve enjeksiyonlar, Nick Donde gerçekleştirmek için Kevin Schwalbach teşekkür ve Katherine Lipari.

Materials

Stereomicroscope with transillumination Leica S6e/ KL300 LED
Manual micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33 Marzhauser M33 Micromanipulator
Pressure Injecion system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Magnetic base holder Applied Scientific Instrumentation Magnetic base
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Iron plate (magnetic base) Narishige IP
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97
Disposable transfer pipettes Fisher 13-711-7M
0.5% phenol red in DPBS Sigma  P0290 injection tracer
#5 forceps, biologie dumoxel  Fine Science Tools 11252-30 for needle breaking
Micropipette Storage Jar World Precision Instruments E210 holds needles
6", 6 teeth per inch plaster drywall saw Lenox 20571 (S636RP) hold eggs for injection
13 cm x 13 cm glass plate any hardware store
Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID  World Precision Instruments 1B100-F4 *harder glass than zebrafish injection capillaries
150 x 15mm petri dish Fisher FB0875714 raise stickleback embryos
35 x 10mm petri dish Fisher 08-757-100A store eggs pre-injection
Instant Ocean Salt Instant Ocean SS15-10
Sodium Bicarbonate Sigma S5761-500G
Tricaine methanesulfonate/MS-222 Western Chemical Inc MS222 fish anaesthesia/euthanasia
Sp6 transcription kit Ambion AM1340 For transcription of TALENs and transposase mRNA
RNeasy cleanup kit Qiagen 74104 purify transposase or TALEN RNA
QiaQuick PCR cleanup kit Qiagen 28104 clean up plasmids for injection
Proteinase K 20 mg/ml Ambion AM2546 for DNA preparation
Nucleobond BAC 100 kit Clontech 740579 for BAC DNA preparation
NotI NEB R0189L
Phusion polymerase Fisher F-530L
Qiagen PlasmidPlus Midi kit Qiagen 12943 contains endotoxin rinse buffer
QIAQuick Gel Extraction Qiagen 28704  for sequencing induced mutations
Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol Sigma P2069-100ML
Sodium acetate Sigma S2889-250G
Ethanol (molecular biology grade) Sigma E7023-500ML
Agarose Sigma A9539
50X Tris-acetate-EDTA buffer ThermoFisher B49
0.5-10KbRNA ladder ThermoFisher 15623-200
Nanodrop  Spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 2000
Paraformaldehyde Sigma 158127-500G
10X PBS ThermoFisher 70011-044
1kb Plus DNA Ladder ThermoFisher 10787-018
Potassium Chloride Sigma P9541-500G
Magnesium Chloride Sigma M8266-100G
NP-40 ThermoFisher 28324
Tween 20 Sigma P1379-500ML
Tris pH 8.3 Teknova T1083
12-strip PCR tube Thermo Scientific AB-1113

References

  1. Bell, M. A., Foster, S. A. . The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , (1994).
  2. Jones, F. C., et al. The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks. Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).
  3. Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).
  4. Miller, C. T., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci. Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).
  5. Shapiro, M. D., et al. Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks. Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).
  6. Colosimo, P. F., et al. Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles. Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).
  7. Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
  8. O’Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA. eLife. , e05290 (2015).
  9. Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
  10. Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822 (2014).
  11. Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. EvoDevo. 5 (1), (2014).
  12. Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. 142, 2442-2451 (2015).
  13. Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).
  14. Hohenlohe, P. A., et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags. PLoS Genet. 6 (2), e1000862 (2010).
  15. McKinnon, J. S., Rundle, H. D. Speciation in nature: the threespine stickleback model systems. Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).
  16. Shao, Y. T., et al. Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).
  17. Katsiadaki, I., et al. Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption. Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).
  18. Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis. Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).
  19. Barber, I. Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology. Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).
  20. Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
  21. Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).
  22. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  23. Carroll, S. B. Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134 (1), 25-36 (2008).
  24. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  25. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  26. Fisher, S., et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).
  27. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  28. Kikuta, H., Kawakami, K. Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors. Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).
  29. Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).
  30. Kingsley, D. M., et al. New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).
  31. Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene. Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).
  32. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  33. Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice. BMC Genomics. 10 (1), 477 (2009).
  34. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  35. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
  36. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  37. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  38. Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
  39. Kawakami, K., et al. A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  40. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning a laboratory manual. , (2012).
  41. Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish. Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).
  42. Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).
  43. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
  44. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) . , (2007).
  45. Dale, R. M., Topczewski, J. Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a. Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).
  46. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  47. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).

Play Video

Cite This Article
Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055, doi:10.3791/54055 (2016).

View Video