Mikroinjeksjon for transgenesis og Genome redigering i Threespine Sticklebacks

Summary

Transgene manipulasjoner og genom redigering er avgjørende for funksjonelt teste rollene som gener og cis-regulatoriske elementer. Her en detaljert mikroinjeksjon protokoll for generering av genomiske modifikasjoner (inkludert Tol2-mediert fluorescerende reporter transgene konstruksjoner, Talens, og CRISPRs) er presentert for emergent modell fisken, trepigget stingsild.

Abstract

Den trepigget stingsild fisk har dukket opp som et kraftig system for å studere genetiske grunnlaget for et bredt utvalg av morfologiske, fysiologiske og atferdsmessige fenotyper. Den bemerkelsesverdig forskjellige fenotyper som har utviklet seg som marine populasjoner tilpasse seg utallige ferskvannsmiljø, kombinert med evnen til å krysse saltvanns- og ferskvanns former, tilveiebringe et sjeldent virveldyr system hvor genetikk kan benyttes til å kartlegge genomiske regioner kontrollerende utviklet seg trekk. Gode ​​ressurser genomiske er nå tilgjengelig, tilrettelegge molekylær genetisk disseksjon av utviklet seg endringer. Mens kartleggingsforsøk generere lister over interessante kandidatgener, er funksjonelle genetiske manipulasjoner for å teste rollene til disse genene. Genregulering kan studeres med transgene reporter plasmider og BACS integrert i genomet bruker Tol2 transposase system. Funksjoner av spesifikke kandidatgener og cis-regulatoriske elementer kan vurderes ved å fremkalle målrettetmutasjoner med Talen og CRISPR / Cas9 genom redigering reagenser. Alle metoder krever innføring av nukleinsyrer inn befruktede én celle stingsild embryo, en oppgave laget utfordrende av den tykke chorion av stingsild embryoer og relativt liten og tynn blastomere. Her er en detaljert protokoll for mikroinjeksjon av nukleinsyrer i stingsild embryoer beskrevet for transgene og genom redigeringsprogrammer for å studere genekspresjon og funksjon, samt teknikker for å vurdere hvor vellykket transgenesis og gjenopprette stabile linjer.

Introduction

En grunnleggende del av å forstå hvordan biologiske mangfoldet oppstår er å avgjøre de genetiske og utviklings baser utviklet fenotypiske endringer i naturen. Den trepigget stingsild fisk, Gasterosteus aculeatus, har dukket opp som en utmerket modell for å studere genetiske grunnlaget for evolusjon. Stingsild har gjennomgått mange adaptive evolusjonære endringer som marine fisk har kolonisert utallige ferskvannsmiljøer rundt den nordlige halvkule, noe som resulterer i dramatisk morfologiske, fysiologiske og atferdsendringer ^1. Genomene av individer fra tjueen stingsild populasjonene er blitt sekvensert og sammenstilt, og en leddforbindelse kart med høy tetthet har blitt generert for ytterligere å forbedre monteringen ^2,3. Genetisk kartlegging eksperimenter har identifisert genomiske regioner underliggende utviklet fenotyper ^4-6, og i noen tilfeller har de funksjonelle rollene til spesifikke kandidat gener testet ^7,8. En rekke genomiske regioner underliggende morfologiske endringer har blitt identifisert med lovende kandidat gener, men disse kandidatene har ennå ikke blitt funksjonelt testet ^9-12. I tillegg stingsild er vanlige modeller for studier av populasjonsgenetikk / genomikk ^13,14, arts ^15, atferd ^1, endokrinologi ^16, økotoksikologi ^17, immunologi ¹⁸ og parasittologi ^19. Fremtidige studier i hvert av disse feltene vil dra nytte av muligheten til å utføre funksjonelle genetiske manipulasjoner i stingsild. I tillegg til å manipulere sine sekvenser, kan rollene som kandidat gener vurderes ved å studere sine cis-regulatoriske sekvenser og fra funksjonelt økende, synkende, eller eliminere uttrykk for kandidaten genet. Mikroinjeksjon og transgenesis metoder i stingsild er godt etablert ^7,8,20 og ble opprinnelig utviklet ved hjelp av en meganuclease-mediertFremgangsmåten ²¹ først beskrevet i medaka ^22. Den modifiserte mikroinjeksjon Metoden som presenteres her er optimalisert for både Tol2-mediert transgenesis og nylig utviklet genom redigering reagenser inkludert Talens og CRISPRs.

Endringer i cis-regulatoriske elementer er antatt å være kritisk for morfologisk evolusjon, som cis-regulatoriske endringer kan unngå de negative pleiotrope konsekvenser av mutasjoner som koder ^23. Derfor teste og sammenligne mulige cis-regulatoriske sekvenser er blitt et sentralt mål for et økende antall evolusjonære studier. I tillegg har de fleste humane sykdomsvarianter regulatoriske varianter ^24,25 og modell virveldyr systemer er sårt tiltrengt for å studere cis-regulatoriske element funksjon og logikk. Fisk som befrukte sine embryoer eksternt i store tall tilby kraftige virveldyr systemer for å studere cis -regulation. Den Tol2 transposon system, der utenrgn DNA som skal integreres i genomet er flankert av transposase Tol2 bindingsseter og ko-injisert med Tol2 transposase mRNA, arbeider med høy virkningsgrad for å lykkes med å integrere plasmid-konstruksjoner inn i fiske genomer ^{26 – 28.} Vanligvis er en potensiell enhancer klonet oppstrøms fra et basal promoter (for eksempel hsp70l ²⁹⁾ og fluorescerende reportergen så som EGFP (forbedret grønt fluorescerende protein) eller mCherry i en Tol2 ryggrad og injisert med mRNA transposase ^26. Observasjon av uttrykk for fluorescerende reporter, enten i injiserte embryoer eller avkom med stabilt integrert transgener, gir informasjon om tid og rom regulering av genekspresjon drevet av den antatte enhancer. I videre forsøk kan validerte forsterkere brukes til å drive vevsspesifikt overekspresjon av gener som er av interesse.

For analyse av større cis-regulatoriske regioner, høy kvalitet, stor-insert genomic bibliotekene ved bruk av bakterie- kunstige kromosomer (Bacs) er konstruert for både saltvanns- og ferskvanns stingsild ^30. Disse BACS kan recombineered for å erstatte et gen med en fluorescerende reporter gen i forbindelse med en stor (150-200 kb) genomisk region ^31. Det fluorescerende reporter blir deretter uttrykt i en tid og rom mønster som bestemmes av regulatoriske sekvenser innenfor BAC. For studier i fisk, kan Tol2 sider legges til BAC å lette genomiske integrasjons ^32,33. I senere stadier av utviklingen når in situ-hybridisering er teknisk utfordrende, kan den fluorescerende avlesning av BAC benyttes til å studere mønstre av genekspresjon, som har blitt vist for stingsild benmorfogenetisk protein 6 (Bmp6) ^20. I tillegg kan fluorescerende ekspresjonsmønstre i et individ kan spores over tid, noe som ikke kan oppnås med in situ-hybridisering. BACS kan også brukes til å legge til en additional kopi av en genomisk region for å øke doseringen av et gen av interesse.

For studier av genfunksjon, er genomet redigering en eksplosjonsartet ekspanderende felt som kan benyttes for å fremstille målrettede endringer av genomiske sekvenser i en rekke forskjellige organismer ^34. Transkripsjons aktivator-lignende effektor nukleaser (Talens) er modulære, sekvensspesifikke nukleaser opprinnelig isolert fra plante patogener som kan presist konstruert for å binde direkte til en genomisk sekvens av valg og generere en dobbel tråd bryte ^35,36. Gruppert regelmessig avbrutt av korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / CAS-systemer ble opprinnelig funnet i bakterier og bruke en guide RNA og Cas9 protein for å generere en pause i en target DNA sekvens som er komplementær til guiden ^37. Den etterfølgende reparasjon av dobbeltstrenget bryte laget av både Talens og CRISPRs ofte etterlater en liten innskudd eller delesjon, noe som kan forstyrre funksjonen av målsekvensen35-37. I stingsild, har Talens blitt brukt til å forstyrre genuttrykk ved å målrette en forsterker ^20, og både Talens og CRISPRs har blitt produsert mutasjoner i sekvensene (upubliserte data). En detaljert protokoll for generering av CRISPRs for bruk i sebrafisk kan brukes som en retningslinje for å utvikle CRISPRs for stingsild ^38.

Transgene og genom redigering eksperimenter kreve innføring av nukleinsyrer inn i en nylig befruktede en celle-embryo. Ved å innføre transgenet eller genom-redigeringsverktøy tidlig i utviklingen, er antallet av genetisk manipulerte datterceller i embryoet maksimert. Injiserte embryoer blir så visuelt skjermet for fluorescens eller molekylært screenet for genom modifikasjoner. Hvis cellene bidrar til kimcellelinje er vellykket målrettet, kan transgenet eller mutasjon bli gitt videre til en undergruppe av avkom, selv når postinjeksjons dødelighet er høy. Mosaikk fisk kan outcrossed ellerintercrossed og deres avkom skjermet for å gjenopprette den muterte alleler eller et stabilt integrert transgen av interesse. Denne protokollen beskriver metoder for å innføre transgener og genom redigering reagenser i ett-celle stingsild embryoer og overvåking for vellykkede genomiske modifikasjoner.

Protocol

All fisk arbeidet ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of California i Berkeley (protokoll nummer R330). 1. Forbered nukleinsyrer for injeksjon Tol2 Plasmid transgenesis (Tilpasset fra Fisher 26). Klipp 10 mikrogram transposase plasmid (PCS-TP) 39 med 10 U Noti i medfølgende buffer for en time ved 37 ° C for å linear. Merk: Material Transfer avtaler kan være nødvendig for å oppnå Tol2 plasmider. Ekstraher kuttet…

Representative Results

For reportergen transgener som har enhancer aktivitet, vil vellykket injeksjon resultere i spesifikk, cellulær ekspresjon av transgenet (figur 4A, 4C). Injiserte fisk kan deretter outcrossed for å fremstille stabile linjer (eksempel på en BAC stabil linje vist i figur 4B). Injisering DNA inn stingsild embryoer vanligvis resulterer i langt høyere dødelighet enn RNA alene. Det er vanlig å se opp til 50% (noen ganger enda mer) letalit…

Discussion

Injisere en celle stingsild embryoer for transgenesis eller genom redigering presenterer tre hovedutfordringer. Først i forhold til sebrafisk embryoer, er stingsild embryonale chorion tøff og vil ofte bryte nåler. Dette problem kan delvis løses ved å anvende tykkere og sterkere glass mikropipetter og injisere vinkelrett på chorion (se protokoll, figur 2). Å sikre at så lite vann som mulig tilsettes til embryoene (akkurat nok til å bevirke at chorion til å svelle og løfte vekk fra celle) bidra…

Materials

Stereomicroscope with transillumination	Leica	S6e/ KL300 LED
Manual micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MM33	Marzhauser M33 Micromanipulator
Pressure Injecion system	Applied Scientific Instrumentation	MPPI-3
Back pressure unit	Applied Scientific Instrumentation	BPU
Micropipette holder kit	Applied Scientific Instrumentation	MPIP
Magnetic base holder	Applied Scientific Instrumentation	Magnetic base
Foot switch	Applied Scientific Instrumentation	FSW
Iron plate (magnetic base)	Narishige	IP
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Disposable transfer pipettes	Fisher	13-711-7M
0.5% phenol red in DPBS	Sigma	P0290	injection tracer
#5 forceps, biologie dumoxel	Fine Science Tools	11252-30	for needle breaking
Micropipette Storage Jar	World Precision Instruments	E210	holds needles
6", 6 teeth per inch plaster drywall saw	Lenox	20571 (S636RP)	hold eggs for injection
13 cm x 13 cm glass plate	any hardware store	–
Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID	World Precision Instruments	1B100-F4	*harder glass than zebrafish injection capillaries
150 x 15mm petri dish	Fisher	FB0875714	raise stickleback embryos
35 x 10mm petri dish	Fisher	08-757-100A	store eggs pre-injection
Instant Ocean Salt	Instant Ocean	SS15-10
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761-500G
Tricaine methanesulfonate/MS-222	Western Chemical Inc	MS222	fish anaesthesia/euthanasia
Sp6 transcription kit	Ambion	AM1340	For transcription of TALENs and transposase mRNA
RNeasy cleanup kit	Qiagen	74104	purify transposase or TALEN RNA
QiaQuick PCR cleanup kit	Qiagen	28104	clean up plasmids for injection
Proteinase K 20 mg/ml	Ambion	AM2546	for DNA preparation
Nucleobond BAC 100 kit	Clontech	740579	for BAC DNA preparation
NotI	NEB	R0189L
Phusion polymerase	Fisher	F-530L
Qiagen PlasmidPlus Midi kit	Qiagen	12943	contains endotoxin rinse buffer
QIAQuick Gel Extraction	Qiagen	28704	for sequencing induced mutations
Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol	Sigma	P2069-100ML
Sodium acetate	Sigma	S2889-250G
Ethanol (molecular biology grade)	Sigma	E7023-500ML
Agarose	Sigma	A9539
50X Tris-acetate-EDTA buffer	ThermoFisher	B49
0.5-10KbRNA ladder	ThermoFisher	15623-200
Nanodrop  Spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Paraformaldehyde	Sigma	158127-500G
10X PBS	ThermoFisher	70011-044
1kb Plus DNA Ladder	ThermoFisher	10787-018
Potassium Chloride	Sigma	P9541-500G
Magnesium Chloride	Sigma	M8266-100G
NP-40	ThermoFisher	28324
Tween 20	Sigma	P1379-500ML
Tris pH 8.3	Teknova	T1083
12-strip PCR tube	Thermo Scientific	AB-1113