간단한 유세포 방법은 전체 혈액에서 단핵구 부분 집단에 대한 당 흡수 및 포도당 운송업자 발현을 측정하는
Summary
Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.
Abstract
단핵구 특정 만성 염증성 질환과 관련된 병원균과 염증에 의해 활성화 될 수있는 선천성 면역 세포이다. 단핵구의 활성화는 이펙터 기능과 향상된 글루코오스 트랜스 포터의 발현을 수반하는 산화 당분 해 대사에서 수반하는 변화를 유도한다. 이 증가 당분 대사는 훈련 된 단핵 세포의 면역 선천성 면역 메모리의 형태로 관찰된다. 단핵 세포에 의해 글루코스 수송 체 발현 및 당 흡수 검사 관내 프로토콜을 설명 하였지만, 없음은 전혈 세포 계측법 다중 파라미터 플로우에 의해 관찰되지 않았다. (중간체 (CD14 ++ CD16 +) 및 비 – 고전 – 우리는 전체 단핵구 및 고전 (CD14 ++ CD16)에 의해 전혈 형광 글루코오스 유사체 2-NBDG 흡수의 측정을위한 다중 파라미터 유세포 프로토콜을 설명 CD14 + CD16 ++) 단핵구소집단. 이 방법은 항상성 및 염증성 질환 중 총 단핵 세포 및 단핵 세포 개체군에 대한 글루코스 수송 체 발현 및 당 흡수를 조사하는데 사용될 수 쉽게 혈액 내의 다른 백혈구 및 백혈구 개체군에 대한 당 흡수를 조사하기 위해 수정 될 수있다.
Introduction
단핵구는 빠르게 감염과 염증 하나의 사이트로 동원 된 인간의 선천성 면역 시스템의 주요 구성 요소입니다. 단핵 세포의 활성화는 병원체에 의한 급성 손상을 제한하기위한 중요하며 또한 죽상 동맥 경화증 2, 암 3, HIV 4,5 등 여러 가지 만성 질환의 발병 기전의 핵심입니다.
휴식 활성화 단핵 세포의 신진 대사는 당분 대사를 (즉, 포도당의 발효 락트합니다)를 이용 산화 대사를 이용하여 휴식 단핵 세포 활성화 단핵 세포와 크게 다르다 6. 단핵 세포의 활성화는 당분 대사 7 증가 포도당 흡수를 허용 포도당 수송 체의 발현을 유도한다. 단핵구 포도당 수송 1 (GLUT1)의 활성화 중에 상향 조절 하나의 수송과 그 표현은 절에서 염증성 사이토 카인의 생산으로 이어질 것으로 나타났다itro 비만 쥐 (8)의 지방 조직입니다. 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스에 의한 단핵구 세포 라인의 감염 GLUT1 9의 휴대 상향 조절로 연결, 우리는 최근에 만성 HIV 감염시 GLUT1 발현 단핵 세포의 증가 비율이 치료와 함께 항 레트로 바이러스 치료 처리 감염 10시 존재하는 것으로 나타났다. 함께 찍은, 이러한 연구는 포도당 흡수 및 단핵 세포에 의한 당분 대사가 많은 염증성 질환의 중요한 측면이라는 것을 보여줍니다. 따라서, 간단한 방법 항상성 동안 단핵구 GLUT1 발현 당 흡수를 측정하고 염증성 질환 연구의 광범위에 유용 할 것으로 예상된다.
인간 단핵구의 세포 표면 마커 CD14 및 CD16 발현 (11, 12)의 차동에 의해 검사 될 수있는 세 개의 서로 다른 서브 세트들로 구성되는 이종이다. 클래식 단핵 세포는 CD14 높은 수준의 표현하지만 CD를 표명하지 아니합니다16 (CD14 ++ CD16은 -), 중간 단핵구는 CD14의 높은 수준 및 CD16 (CD14 + CD16 +)의 중간 레벨 및 단핵구는 CD14의 로우 레벨과 CD16의 높은 레벨을 발현 비 고전적 (CD14을 발현 + CD16 ++). CD16을 표현 단핵구는 CD16에 비해 CD16 + 단핵 세포를 불린다 – 단핵구 높은 염증성 사이토 카인의 발현과 기능을보다 효율적으로 존재하는 항원 (13, 14)에 있습니다. 단핵 세포의 약 10 %는 염증 15 일 동안 관찰 높은 비율과 항상성 동안 CD16를 표현한다. 단핵 세포 개체군은 특정 질병 상태와 관련된 질병과 질병의 진행 (16)의 유용한 생물 마커 될 수 있습니다.
우리의 목표는 PHY에 가까운 조건에서 인간 단핵 세포와 단핵구 소집단에 의한 포도당 수송 체의 발현과 포도당 흡수를 측정 할 수있는 방법을 확인하는 것이 었습니다가능한 한 siological 조건. 이러한 방법은 생리적 조건 (19)에 비해 단백질 발현을 변경 한 수 절연 단핵구를 조사하더라도 이전의 연구는, 단구 글루코스 수송 체 발현 및 당 흡수 17,18을 측정하고, 더 이전의 연구는 인간 단핵 세포 개체군을 조사하지 않았다. 계측법 다중 파라미터의 흐름을 이용하여, 총 단핵 세포 및 단핵 세포 개체군에 의해 형광 글루코오스 유사체 2-NBDG 글루코오스 트랜스 포터의 발현 및 흡수를 검사하는 방법을 설명하는 전체 조작되지 혈액 내 (CD14 및 CD16의 발현에 기초하여).
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 전체 혈액의 단핵 세포 및 단핵 세포 개체군에 의해 글루코스 수송 식 형광 글루코오스 유사체 흡수를 조사하는 간단한 방법을 자세히. 전혈에서 2-NBDG 흡수를 평가하여,이 방법은 생체 내에서 유사한 조건을 허용한다. 이전의 연구는 밀도 원심 분리 (17)에 의해 전혈로부터 분리 된 단핵 세포에서 6 NBDG 흡수를 조사 하였다. 그러나,이 연구는 잠재적으로 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 HIV와 간염 바이러스학 연구 AIDS 연구를위한 워싱턴 센터의 대학 (CFAR), 지원되는 보너스 번호 AI027757 아래 NIH 자금 지원 프로그램 (ACH 2), 2010 년 개발 보조금 (CNIHR)에 대한 호주 센터에 의해 투자되었다 다음 NIH 연구소 및 센터 (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA)에 의해. CSP는 CNIHR 및 ACH 2 보조금받는 사람입니다. SMC는 호주 (NHMRC) 주요 연구 활동의 국립 보건 의료 연구위원회의받는 사람입니다. 저자는 기꺼이 버네 연구소에 의해 수신 된 빅토리아 운영 인프라 지원 프로그램의이 작품에 대한 기여를 인정합니다. 우리는 교육 및 기술 자문 유동 세포 계측법에 대한 AMREP 유동 세포 계측법 핵심 시설에서 게자 Paukovic 에바 ORLOWSKI – 올리버의 도움을 인정합니다. 우리는 미디어 코칭 및 비디오 촬영 조직 앵거스 모건 감사합니다. 우리의 감사제시 메이슨과 뽑아 낸 압둘라지즈 K. Alzahrani에 비디오 촬영 중 실험실 지원. 우리는 중요한 방법론적인 조언을 제공하는 의료 과학, UNSW, 호주의 학교에서 박사 데이비드 SIMAR의 노력을 주셔서 감사합니다. CSP는 감사의 말씀을 www.nice-consultants.com를 그래픽 협의.
저자의 기여 :
CSP는 프로젝트를 구상 설계 및 실험을 실시, 분석 및 데이터를 해석하고, 원고를 썼다. JJA 데이터를 해석하고 원고를 썼다. TRB는 원고를 썼다. JMM는, 데이터를 해석 중요한 지적 제안을했고, 원고를 검토했다. SMC는, 데이터를 해석 중요한 지적 제안을했고 원고를 검토했다.
Materials
| VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml sterile polypropylene tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16% formaldehyde solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BD FACS lysing solution (10X) | BD Biosciences | 349202 | Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C) |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Life technologies | 14190-144 | To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C) |
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