وتدفق Cytometric بسيط طريقة لقياس امتصاص الغلوكوز والجلوكوز التعبير الناقل للالقطعان الوحيدات في الدم الكامل
Summary
Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.
Abstract
حيدات هي الخلايا المناعية الفطرية التي يمكن تفعيلها عن طريق الجراثيم والالتهابات المصاحبة لبعض الأمراض الالتهابية المزمنة. تفعيل حيدات يدفع ظائف المستجيب وتحول ما يصاحب ذلك من التأكسدي للالأيض حال السكر الذي يصحبه زيادة في التعبير الجلوكوز نقل. لوحظ هذا زيادة الأيض حال السكر أيضا للحصانة المدربين من وحيدات، وشكلا من أشكال الذاكرة المناعية الفطرية. على الرغم من أن في المختبر بروتوكولات دراسة التعبير الجلوكوز نقل وامتصاص الغلوكوز من قبل حيدات وقد وصفت، وقد تم فحص أيا من تدفق متعدد حدودي الخلوي في الدم الكامل. نحن تصف بروتوكول تدفق cytometric متعددة حدودي لقياس الفلورسنت الجلوكوز التناظرية 2-NBDG امتصاص في الدم الكامل من قبل مجموع وحيدات الكلاسيكية (CD14 + CD16 -)، وسيطة (CD14 + CD16 +) وغير التقليدية ( CD14 + CD16 + +) الوحيداتالقطعان. هذه الطريقة يمكن استخدامها لدراسة التعبير نقل الجلوكوز وامتصاص الجلوكوز لمجموع وحيدات القطعان الوحيدات خلال التوازن وأمراض التهابات، ويمكن تعديلها بسهولة لدراسة امتصاص الجلوكوز لكريات الدم البيضاء الأخرى، والقطعان الكريات البيض في الدم.
Introduction
حيدات هي مكون رئيسي من نظام المناعة الفطري البشري التي يتم تعبئتها بسرعة إلى مواقع الإصابة والتهاب 1. تفعيل حيدات أمر بالغ الأهمية للحد من الضرر الحاد عن طريق الجراثيم وأيضا المركزي إلى التسبب في العديد من الأمراض المزمنة، بما في ذلك تصلب الشرايين 2، والسرطان 3، وفيروس نقص المناعة البشرية 4،5.
عملية التمثيل الغذائي للراحة وحيدات تنشيط يختلف بشكل كبير، مع الراحة وحيدات استخدام الأيض المؤكسدة وحيدات تنشيط استخدام الأيض حال السكر (أي تخمر الجلوكوز إلى اللاكتات) 6. تفعيل حيدات يدفع التعبير عن ناقلات الجلوكوز الذي يسمح لزيادة امتصاص الجلوكوز لعملية التمثيل الغذائي حال السكر 7. الوحيدات الجلوكوز نقل 1 (GLUT1) هي واحدة من هذا القبيل نقل upregulated خلال تفعيل ولقد ثبت تعبيرها أن تؤدي إلى إنتاج السيتوكينات الموالية للالتهابات في الخامسitro وفي الأنسجة الدهنية من الفئران السمينة 8. إصابة خط خلية الوحيدات كابوسي ساركوما المرتبطة هربس يؤدي إلى upregulation الخلوي للGLUT1 9، وأظهرنا مؤخرا أنه خلال عدوى مزمنة بفيروس نقص المناعة البشرية زيادة النسبة المئوية من وحيدات، معربا عن GLUT1 موجودة أثناء غير المعالجة والجمع بين المعالجة بمضادات الفيروسات القهقرية علاج العدوى 10. أخذت معا، وتبين هذه الدراسات أن امتصاص الجلوكوز واستقلاب حال السكر حيدات جوانب مهمة من العديد من الأمراض الالتهابية. وهكذا، طريقة بسيطة لقياس التعبير GLUT1 الوحيدات وامتصاص الجلوكوز خلال التوازن ومرض التهاب من المرجح أن تكون ذات فائدة لمجموعة واسعة من الباحثين.
حيدات الإنسان غير متجانسة، التي تتألف من ثلاث مجموعات فرعية المميزة التي يمكن أن يفحصه التعبير التفاضلية من CD14 علامات سطح الخلية وCD16 11،12. حيدات الكلاسيكية تعبر عن مستوى عال من CD14 ولكن لا تعبر CD16 (CD14 + CD16 -)، وحيدات وسيطة تعبر عن مستوى عال من CD14 والمستوى المتوسط من CD16 (CD14 + CD16 +)، وغير الكلاسيكية حيدات تعبر عن مستوى منخفض من CD14 وعلى مستوى عال من CD16 (CD14 + CD16 + +). وتسمى حيدات التي تعبر عن CD16 CD16 + حيدات، والتي بالمقارنة مع CD16 – حيدات لها التعبير عالية من السيتوكينات الالتهابية والقدرة على نحو أكثر فعالية المضادات الحالية 13،14. ما يقرب من 10٪ من وحيدات تعبر عن CD16 خلال التوازن مع نسب أعلى لوحظت خلال التهاب 15. وترتبط القطعان الوحيدات مع الحالات المرضية معينة، ويمكن أن تكون علامات بيولوجية مفيدة من المرض وتطور المرض 16.
وكان لدينا هدف لتحديد الطريقة التي يمكن قياس التعبير نقل الجلوكوز وامتصاص الغلوكوز من قبل حيدات الإنسان والقطعان الوحيدات في ظروف أقرب إلى فيزشروط siological وقت ممكن. وكانت دراسات سابقة قياس التعبير نقل الوحيدات الجلوكوز وامتصاص الغلوكوز 17،18، على الرغم من هذه الأساليب فحص حيدات المعزولة التي يمكن غيرت تعبير البروتين مقارنة مع الظروف الفسيولوجية 19، وأي دراسة سابقة درست القطعان الوحيدات الإنسان. باستخدام التدفق متعدد حدودي الخلوي، نحن تصف طريقة لدراسة التعبير نقل الجلوكوز وامتصاص الجلوكوز التناظرية الفلورسنت 2-NBDG على إجمالي حيدات والقطعان الوحيدات (على أساس CD14 والتعبير CD16) في الدم unmanipulated كله.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا تفاصيل طريقة بسيطة لدراسة التعبير نقل الجلوكوز والفلورسنت امتصاص الغلوكوز التناظرية التي كتبها الوحيدات والوحيدات القطعان في الدم الكامل. من خلال تقييم 2-NBDG امتصاص في الدم الكامل، وهذا الأسلوب يسمح للظروف مماثلة لتلك الموجودة في الجسم الحي….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا البحث من قبل المركز الأسترالي للفيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد الفيروسات الأبحاث (ACH 2) ومنحة التنموي 2010 (CNIHR) من جامعة مركز واشنطن لأبحاث الإيدز (CFAR)، وهو برنامج تموله المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم جائزة AI027757 الذي تدعمه من قبل المعاهد التالية المعاهد الوطنية للصحة ومراكز (المعهد المذكور، NCI، صحة العقلية، النداء، معاهد الصحة القومية، NHLBI، وكالة الاستخبارات الوطنية). CSP هي المستفيدة من منحة 2 CNIHR ومنظمة العمل ضد الجوع. SMC هي المستفيدة من مجلس صحة و طب القومي للبحوث في استراليا (NHMRC) مدير أبحاث زمالة. والكتاب الامتنان للمساهمة في هذا العمل لبرنامج دعم البنية التحتية التشغيلي الفيكتوري من قبل معهد بيرنت حصل. ونحن نعترف مساعدة جيزا Paukovic وإيفا أورلوسكي-أوليفر من مرفق AMREP التدفق الخلوي الأساسية لالتدفق الخلوي التدريب والمشورة التقنية. نشكر انجوس مورغان للتدريب وسائل الإعلام وتنظيم تبادل لاطلاق النار الفيديو. امتناننالجيسي ماسون وجهاد عبدالعزيز خالد الزهراني للمساعدة مختبر أثناء تصوير الفيديو. نشكر جهود الدكتور ديفيد SIMAR في كلية العلوم الطبية، نيو ساوث ويلز، أستراليا الذي قدم المشورة المنهجية حرجة. سوف CSP أود أن أشكر www.nice-consultants.com للتشاور الرسوم البيانية.
المؤلفين مساهمة:
تصور CSP المشروع وتصميم وتنفيذ التجارب وتحليلها وتفسيرها البيانات، وكتب مخطوطة. JJA تفسير البيانات وكتب مخطوطة. كتب TRB المخطوطة. JMM تفسير البيانات، قدمت اقتراحات الفكرية الهامة، واستعرض المخطوطة. SMC تفسير البيانات، قدمت اقتراحات الفكرية الهامة واستعرض المخطوطة.
Materials
| VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml sterile polypropylene tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16% formaldehyde solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BD FACS lysing solution (10X) | BD Biosciences | 349202 | Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C) |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Life technologies | 14190-144 | To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C) |
References
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
- Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
- Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
- Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. , (2016).
- Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
- Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
- Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
- Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
- Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
- Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
- Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
- Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
- Ziegler-Heitbrock, L. . Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. , 3-36 (2014).
- Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
- Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
- Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
- Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
- Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
- Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
- Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
- Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
- Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
- Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. , 1-12 (2015).
- Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection?. AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
- McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
- Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
- Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. , 80-90 (2016).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
- Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
- Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
- Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
- Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
- Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
- Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
- Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196 (11), 4437-4444 (2016).
