Een eenvoudige Flowcytometrische methode om te meten glucose opname en Glucose Transporter Expression voor monocyten subpopulaties in volbloed
Summary
Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.
Abstract
Monocyten zijn aangeboren immuuncellen die kan worden geactiveerd door pathogenen en ontsteking geassocieerd met bepaalde chronische ontstekingsziekten. Activatie van monocyten induceert effectorfuncties en een gelijktijdige verschuiving van oxidatieve naar glycolytische stofwisseling die gepaard gaat met verhoogde glucose transporter expressie. Deze verhoogde glycolytische stofwisseling wordt ook waargenomen voor de geoefende immuniteit van monocyten, een vorm van aangeboren immunologisch geheugen. Hoewel in vitro onderzoek protocollen glucose transporter expressie en glucose opname door monocyten zijn beschreven, zijn geen onderzocht door multi-parametrische flowcytometrie in volbloed. We beschrijven een multi-parametrische flowcytometrische protocol voor het meten van fluorescentie glucose analoge 2-NBDG opname in volbloed door totale monocyten en de klassieke (CD14 ++ CD16 -), tussenproduct (CD14 ++ CD16 +) en niet-klassieke ( CD14 + CD16 ++) monocytsubpopulaties. Deze methode kan worden gebruikt om glucose transporter expressie en glucoseopname voor totale monocyten en monocyt subpopulaties bij homeostase en ontstekingsziekten onderzocht en kunnen eenvoudig worden aangepast om glucoseopname andere leukocyten en leukocyten subpopulaties binnen bloed onderzocht.
Introduction
Monocyten zijn een belangrijk onderdeel van de menselijke aangeboren immuunsysteem die snel gemobiliseerd naar plaatsen van infectie en ontsteking 1. Activatie van monocyten is kritisch voor het beperken van acute schade door ziekteverwekkers en is centraal in de pathogenese van een aantal chronische ziekten, waaronder atherosclerose 2, 3 kanker, HIV en 4,5.
Het metabolisme van rustende en geactiveerde monocyten verschilt dramatisch, met rustende monocyten gebruik oxidatief metabolisme en geactiveerde monocyten gebruikmaking glycolytische stofwisseling (dwz fermentatie van glucose tot lactaat) 6. Activatie van monocyten induceert expressie van glucose transporters die zorgt voor verhoogde glucoseopname voor glycolytische stofwisseling 7. Monocyt glucose transporter 1 (GLUT1) is een dergelijke transporteur opgereguleerd tijdens activatie en zijn expressie is aangetoond dat leidt tot de productie van pro-inflammatoire cytokines in vitro en in vetweefsel van obese muizen 8. Infectie van een monocytische cellijn door Kaposi-sarcoom geassocieerd herpesvirus leidt tot cellulaire opregulatie van GLUT1 9, en we onlangs bleek dat tijdens chronische hiv-infectie een verhoogd percentage van GLUT1 uitdrukken monocyten tijdens onbehandeld en antiretrovirale therapie behandeld infectie 10 aanwezig zijn. Samengevat, deze studies tonen aan dat glucose en glycolytische metabolisme door monocyten zijn belangrijke aspecten van vele ontstekingsziekten. Dus een eenvoudige methode om monocyten GLUT1 expressie en glucose meten die homeostase en ontstekingsziekte waarschijnlijk van nut zijn voor een groot aantal onderzoekers.
Menselijke monocyten zijn heterogeen, wordt samengesteld uit drie verschillende subsets die door differentiële expressie van het celoppervlak markers CD14 en CD16 11,12 kunnen worden onderzocht. Classical monocyten drukken een hoog niveau van CD14, maar niet uit te drukken CD16 (CD14 ++ CD16 -), tussenproduct monocyten een hoog niveau van CD14 en een tussenliggend niveau van CD16 (CD14 ++ CD16 +) en niet-klassieke monocyten een lage CD14 en een hoog niveau van CD16 (CD14 + CD16 ++). Monocyten die CD16 tot expressie zogenaamde CD16 + monocyten, die vergeleken met CD16 – monocyten hoge expressie van inflammatoire cytokines en het vermogen om beter te presenteren antigenen 13,14. Ongeveer 10% van de monocyten CD16 tijdens homeostase met hogere percentages waargenomen gedurende 15 inflammatie. Monocyt subpopulaties houden bepaalde ziektetoestanden en mogelijk bruikbare biologische markers van de ziekte en ziekteprogressie 16.
Ons doel was om een methode die glucose transporter expressie en glucose-opname door humane monocyten en monocyt subpopulaties onder omstandigheden zo dicht mogelijk bij phy kan meten identificerensiological voorwaarden mogelijk. Eerdere studies gemeten monocyten glucose transporter expressie en opname van glucose 17,18, hoewel deze methoden geïsoleerde monocyten die kunnen hebben veranderd eiwitexpressie in vergelijking met fysiologische omstandigheden 19 onderzocht, en geen eerdere studie heeft de menselijke monocyten subpopulaties onderzocht. Gebruik van multi-parametrische flowcytometrie beschrijven we een werkwijze glucose transporter expressie en opname van de fluorescente glucose analoge 2-NBDG van totale monocyten en monocyt subpopulaties onderzocht (op basis van CD14 en CD16 expressie) binnen het gehele ongemanipuleerd bloed.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven protocol Gegevens een eenvoudige methode om glucose transporter expressie en fluorescerende glucose analoge opname door monocyten en monocyt subpopulaties in volbloed onderzocht. Door beoordeling 2-NBDG opname in volbloed, deze techniek maakt soortgelijke omstandigheden als in vivo. Een eerdere studie onderzocht 6-NBDG opname in monocyten gescheiden van volbloed door dichtheidscentrifugatie 17. Echter, deze studie niet onderzocht monocyten subpopulaties en scheiding van monocyten u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door de Australische Centrum voor HIV en Hepatitis Virologie Research (ACH 2) en een 2010 ontwikkelingsstoornissen subsidie (CNIHR) van de Universiteit van Washington Center for AIDS Research (CFAR), een NIH gefinancierd programma onder award nummer AI027757 die wordt ondersteund door de volgende NIH Institutes en Centers (NIAID, NCI, NIMH, Nida, NICHD, NHLBI, NIA). CSP is een ontvanger van de CNIHR en ACH 2 subsidie. SMC is een ontvanger van een National Health en Medical Research Council of Australia (NHMRC) Principal Research Fellowship. De auteurs zeer erkentelijk voor de bijdrage aan het werk van het Victoriaanse operationele infrastructuur Support Program door de Burnet Institute ontvangen. Wij erkennen de hulp van Geza Paukovic en Eva Orlowski-Oliver uit de AMREP Flow Cytometry Core Faciliteit voor flowcytometrie training en technisch advies. Wij danken Angus Morgan voor media-coaching en organisatie van de video shoot. onze dankJesse Masson en Jehad Abdulaziz K. Alzahrani voor lab begeleiding tijdens de video shoot. Wij danken de inspanningen van Dr. David Simar aan de School of Medical Sciences, UNSW, Australië die kritisch methodologisch advies aangeboden. CSP danken www.nice-consultants.com voor grafische overleg.
AUTEURS 'BIJDRAGE:
CSP bedacht het project, ontworpen en experimenten, geanalyseerd en geïnterpreteerd data, en schreef het manuscript. JJA geïnterpreteerd gegevens en schreef het manuscript. TRB schreef het manuscript. JMM geïnterpreteerd data, maakte kritische intellectuele suggesties, en het manuscript beoordeeld. SMC interpreteren van gegevens, maakte kritische intellectuele suggesties en het manuscript beoordeeld.
Materials
| VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml sterile polypropylene tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16% formaldehyde solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BD FACS lysing solution (10X) | BD Biosciences | 349202 | Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C) |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Life technologies | 14190-144 | To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C) |
References
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
- Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
- Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
- Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. , (2016).
- Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
- Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
- Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
- Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
- Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
- Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
- Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
- Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
- Ziegler-Heitbrock, L. . Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. , 3-36 (2014).
- Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
- Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
- Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
- Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
- Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
- Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
- Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
- Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
- Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
- Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. , 1-12 (2015).
- Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection?. AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
- McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
- Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
- Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. , 80-90 (2016).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
- Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
- Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
- Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
- Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
- Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
- Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
- Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196 (11), 4437-4444 (2016).
