A Fluxo Simples Citometria método para medir glicose Captação e expressão de transportadores de glicose para monócitos subpopulações em sangue total
Summary
Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.
Abstract
Os monócitos são células imunitárias inatas que podem ser ativadas por patógenos e inflamação associados a certas doenças inflamatórias crónicas. A activação de monócitos induzem funções efectoras e um deslocamento concomitante da oxidativo ao metabolismo glicolítico que é acompanhada por um aumento da expressão do transportador de glucose. Este aumento do metabolismo glicolítico é também observada para a imunidade treinada de monócitos, uma forma de memória imunológica inata. Embora os protocolos in vitro que examinam a expressão do transportador de glucose e a captação de glicose pelos monócitos foram descritos, nenhum foi examinado por fluxo multi-paramétrico citometria em sangue total. Descreve-se um protocolo de citometria de fluxo multi-paramétrica para a medição da absorção de glucose análogo 2-NBDG fluorescente no sangue total pelo total de monócitos e a clássica (CD16 ++ CD14 -), intermediário (CD14 ++ CD16 +) e não clássico ( CD14 + CD16 ++) de monócitossubpopulações. Este método pode ser usado para examinar a expressão do transportador de glucose e a captação de glucose para o total de monócitos e subpopulações de monócitos durante a homeostase e doenças inflamatórias, e pode ser facilmente modificado para analisar a absorção de glucose por outros leucócitos e subpopulações de leucócitos de sangue dentro.
Introduction
Os monócitos são um dos principais componentes do sistema imune inato humano que são rapidamente mobilizados para os locais de infecção e inflamação 1. Activação dos monócitos é fundamental para limitar os danos aguda por patógenos e também é central para a patogênese de diversas doenças crônicas, incluindo a aterosclerose 2, do cancro de 3, e HIV 4,5.
O metabolismo de repouso e monócitos ativados difere radicalmente, com monócitos descansando utilizando metabolismo oxidativo e monócitos activados utilizando metabolismo glicolítico (ou seja, a fermentação da glicose em lactato) 6. A activação de monócitos induz a expressão dos transportadores de glicose que permite maior captação de glicose para o metabolismo glicolítico 7. transportador de glucose de monócitos 1 (GLUT1) é um tal transportador regulada positivamente durante a activação e a sua expressão tem sido mostrado para levar a produção de citocinas pro-inflamatórias em vITRO e no tecido adiposo de ratos obesos 8. A infecção de uma linha celular monocítica de sarcoma de Kaposi associada herpesvírus leva à sobre-regulação celular da Glut1 9, e, recentemente, mostraram que durante a infecção crónica pelo HIV um aumento da percentagem de monócitos que expressam GLUT1 estão presentes durante a infecção tratados com terapia anti-retroviral não tratada e 10 combinação. Tomados em conjunto, estes estudos mostram que a absorção de glicose e metabolismo glicolítico por monócitos são aspectos importantes de muitas doenças inflamatórias. Assim, um método simples para medir a expressão de monócitos GLUT1 e a absorção de glicose durante a homeostase e doença inflamatória é provável que seja de utilização de uma vasta gama de pesquisadores.
Os monócitos humanos são heterogéneo, sendo compreendido de três subconjuntos distintos que podem ser examinados por expressão diferencial de CD14 a marcadores da superfície celular CD16 e 11,12. Classical monócitos expressam um alto nível de expressão de CD14, mas não expressam CD16 (CD14 ++ CD16 -), monócitos intermediários expressam um alto nível de CD14 e um nível intermediário de CD16 (CD14 ++ CD16 +), e não-clássica monócitos expressam um baixo nível de CD14 e um alto nível de CD16 (CD14 + CD16 ++). Os monócitos que expressam CD16 são denominados CD16 + monócitos, que em comparação com CD16 – monócitos têm alta expressão de citoquinas inflamatórias e a capacidade para mais efectivamente apresentar antigénios 13,14. Aproximadamente 10% dos monócitos expressam CD16 durante a homeostase com percentagens mais elevadas observadas durante a inflamação 15. Subpopulações de monócitos estão associados com certos estados de doença e podem ser marcadores biológicos úteis de doença e progressão da doença 16.
Nosso objetivo foi identificar um método que pode medir a expressão transportador de glicose e captação de glicose pelos monócitos humanos e subpopulações de monócitos em condições tão próximas phycondições fisiológi- possível. Estudos anteriores medido expressão do transportador de glucose de monócitos e a absorção de glicose 17,18, embora estes métodos examinados monócitos isolados que pode ter alterado a expressão da proteína em comparação com as condições fisiológicas 19, e nenhum estudo anterior examinou subpopulações de monócitos humanos. Usando fluxo multi-paramétrico citometria, nós descrevemos um método para examinar a expressão do transportador de glucose e a absorção do análogo de glucose fluorescente 2-NBDG pelo total de monócitos e subpopulações de monócitos (com base em CD14 e CD16 expressão) dentro de sangue inteiro não manipulada.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui detalha um método simples para examinar a expressão transportador de glicose e captação analógica glucose fluorescente por monócitos e monócitos subpopulações em sangue total. Ao avaliar a absorção de 2-NBDG em sangue total, esta técnica permite condições semelhantes aos in vivo. Um estudo anterior analisou-6 em monócitos NBDG absorção separadas do sangue total por centrifugação de densidade de 17. No entanto, este estudo não avaliou subpopulações de mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo Centro Australiano para HIV e Hepatite Virology Research (ACH 2) e uma subvenção de desenvolvimento de 2010 (CNIHR) da Universidade de Washington Center for AIDS Research (CFAR), um programa NIH financiados sob o número prêmio AI027757 que é apoiado pelo seguinte NIH institutos e centros (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP é um receptor da concessão 2 CNIHR e ACH. SMC é um destinatário de uma Health and Medical Conselho Nacional de Pesquisa da Austrália (NHMRC) principal Research Fellowship. Os autores agradecem a contribuição para este trabalho do Programa de Apoio Infra-estrutura Operacional Victorian recebido pelo Instituto Burnet. Nós reconhecemos a assistência de Geza Paukovic e Eva Orlowski-Oliver do Mecanismo AMREP Citometria de Fluxo Núcleo de citometria de fluxo formação e aconselhamento técnico. Agradecemos Angus Morgan para o treinamento de mídia e organização da gravação do vídeo. nossa gratidãopara Jesse Masson e Jehad Abdulaziz K. Alzahrani de assistência laboratório durante a gravação do vídeo. Agradecemos os esforços do Dr. David Simar da Faculdade de Ciências Médicas da UNSW, Austrália, que ofereceu aconselhamento metodológico crítico. CSP gostaria de agradecer www.nice-consultants.com de consultas gráficas.
CONTRIBUIÇÃO DOS AUTORES:
CSP concebeu o projeto, concebido e realizado experimentos, analisados e interpretados de dados, e escreveu o manuscrito. JJA interpretado de dados e escreveu o manuscrito. TRB escreveu o manuscrito. JMM interpretado de dados, fizeram sugestões intelectuais críticos e revisão do manuscrito. SMC interpretado de dados, fizeram sugestões intelectuais críticos e revisão do manuscrito.
Materials
| VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml sterile polypropylene tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16% formaldehyde solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BD FACS lysing solution (10X) | BD Biosciences | 349202 | Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C) |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Life technologies | 14190-144 | To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C) |
References
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
- Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
- Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
- Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. , (2016).
- Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
- Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
- Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
- Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
- Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
- Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
- Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
- Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
- Ziegler-Heitbrock, L. . Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. , 3-36 (2014).
- Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
- Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
- Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
- Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
- Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
- Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
- Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
- Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
- Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
- Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. , 1-12 (2015).
- Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection?. AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
- McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
- Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
- Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. , 80-90 (2016).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
- Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
- Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
- Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
- Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
- Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
- Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
- Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196 (11), 4437-4444 (2016).
