Простой проточной цитометрии метод измерения глюкозы и глюкозы Transporter выражение для моноцитов субпопуляциях в цельной крови
Summary
Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.
Abstract
Моноциты врожденные иммунные клетки, которые могут быть активированы патогенами и воспаления, связанные с некоторыми хроническими воспалительными заболеваниями. Активация моноцитов индуцирует эффекторные функции и сопутствующий сдвиг от окислительного к гликолитического метаболизма, что сопровождается повышением экспрессии переносчика глюкозы. Этот повышенный метаболизм гликолиза наблюдается также для обученного иммунитета моноцитов, форма врожденной иммунологической памяти. Хотя пробирке протоколы изучения экспрессии переносчика глюкозы и поглощение глюкозы моноцитов были описаны, ни один не был рассмотрен многопараметрического проточной цитометрии в цельной крови. Мы опишем многопараметрических протокол проточной цитометрии для измерения флуоресцентного аналогового поглощения глюкозы 2-NBDG в цельной крови на общее число моноцитов и классической (CD14 ++ CD16 -) промежуточное соединение (CD14 ++ CD16 +) и неклассической ( CD14 + CD16 ++) моноцитовсубпопуляции. Этот метод может быть использован для изучения экспрессии глюкозы транспортерные и поглощение глюкозы для общего количества моноцитов и моноцитов субпопуляции во время гомеостаза и воспалительного заболевания, и может быть легко изменен, чтобы исследовать поглощение глюкозы для других лейкоцитов и субпопуляций лейкоцитов в пределах крови.
Introduction
Моноциты являются одним из основных компонентов человеческого врожденной иммунной системы, которые быстро мобилизован к очагов инфекции и воспаления 1. Активация моноцитов имеет решающее значение для ограничения острое поражение патогенами и также играет центральную роль в патогенезе некоторых хронических заболеваний, в том числе атеросклероза , 2, 3, рака и ВИЧ 4,5.
Метаболизм отдыха и активированных моноцитов резко отличается, с покоящихся моноцитов с использованием окислительного метаболизма и активированных моноцитов с использованием гликолиза метаболизм (т.е. ферментации глюкозы в лактат) 6. Активация моноцитов индуцирует экспрессию переносчиков глюкозы , что позволяет увеличить поглощение глюкозы для гликолитического метаболизма 7. Транспортер моноцитов глюкозы 1 (GLUT1) является одним из таких Транспортер активируется во время активации и его выражение было показано, что приведет к созданию провоспалительных цитокинов в VITRO и в жировой ткани мышей с ожирением 8. Заражение клеточной линии моноцитов по саркома Капоши , связанный герпесвирусов приводит к клеточной повышающей регуляции GLUT1 9, и мы недавно показали , что при хронической ВИЧ – инфекции повышенный процент GLUT1-экспрессирующих моноцитов присутствуют во время необработанной и комбинированной антиретровирусной терапии лечение инфекции 10. Взятые вместе, эти исследования показывают, что потребление глюкозы и гликолиза метаболизм моноциты являются важными аспектами многих воспалительных заболеваний. Таким образом, простой способ для измерения экспрессии GLUT1 моноцитов и поглощение глюкозы во время гомеостаза и воспалительное заболевание, вероятно, будет полезным для широкого круга исследователей.
Человеческие моноциты являются гетерогенными, которые состоят из трех различных подмножеств , которые могут быть исследованы с помощью дифференциальной экспрессии CD14 маркеров клеточной поверхности и CD16 11,12. Классические моноциты экспрессируют высокий уровень CD14, но не экспрессируют CD16 (CD14 ++ CD16 -), промежуточные моноциты экспрессируют высокий уровень CD14 и промежуточный уровень CD16 (CD14 ++ CD16 +), и неклассический моноциты экспрессируют низкий уровень CD14 и высокий уровень CD16 (CD14 + CD16 ++). Моноциты , которые выражают CD16 называются CD16 + моноциты, которые по сравнению с CD16 – моноциты имеют высокую экспрессию воспалительных цитокинов и способность более эффективно представляют антигены 13,14. Примерно 10% моноциты экспрессируют CD16 в течение гомеостаза с более высокими процентами , наблюдаемых во время воспаления 15. Моноцитов субпопуляции связаны с определенными болезненными состояниями и могут быть полезными биологическими маркерами прогрессирования заболевания и заболевания 16.
Наша цель состояла в том, чтобы определить метод, который может измерять глюкозы экспрессию транспортеров и поглощение глюкозы человеческих моноцитов и моноцитов субпопуляций в условиях, близких к PHYsiological условия, как это возможно. Предыдущие исследования измеряли экспрессию переносчика глюкозы моноцитов и поглощение глюкозы 17,18, хотя эти методы рассмотрены отдельные моноциты , которые могут иметь измененную экспрессию белка по сравнению с физиологических условиях 19, и никакое предыдущее исследование не исследовал субпопуляции моноцитов человека. Использование многопараметрических проточной цитометрии, мы опишем метод для изучения глюкозы выражение транспортерные и поглощение флуоресцентного аналога глюкозы 2-NBDG по общему объему моноцитов и моноцитов субпопуляций (на основе CD14 и CD16 экспрессии) в течение всей unmanipulated крови.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь подробно описан простой метод для изучения глюкозы экспрессии переносчика и люминесцентную глюкозы аналоговый поглощение моноцитов и моноцитов субпопуляций в цельной крови. Оценивая поглощение 2-NBDG в цельной крови, эта методика позволяет условиях , аналогич…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было профинансировано Австралийским центром по борьбе с ВИЧ и гепатита вирусологии исследований (ACH 2) и 2010 грант развития (CNIHR) из Университета штата Вашингтон Центра исследований СПИДа (CFAR), в NIH финансируемой программы под удостоенный номером AI027757 , которая поддерживается следующим NIH институтов и центров (NIAID, NCI, NiMH-, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). СНТ является получателем гранта 2 CNIHR и ACH. SMC является получателем национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (NHMRC) Основные научные стипендии. Авторы выражают признательность за вклад в эту работу викторианской Оперативной программы инфраструктуры поддержки, полученной Бернет институтом. Мы признаем помощь Геза Paukovic и Ева орловского-Оливер из AMREP проточной цитометрии основной комплекс для проточной цитометрии подготовки и технических консультаций. Мы благодарим Angus Морган для тренерской медиа и организации съемок клипа. Наша благодарностьДжесси Массона и Джихад Абдулазиз К. Alzahrani для лабораторной помощи во время видеосъемки. Мы благодарим усилия д-ра Дэвида Simar в школе медицинских наук, UNSW, Австралия, которые предложили критические методологические рекомендации. СКП хотел бы поблагодарить www.nice-consultants.com для графических консультаций.
ВКЛАД Авторов:
СНТ задумал проект, разработанный и провели эксперименты, анализ и интерпретация данных, и написал рукопись. JJA интерпретировать данные и написал рукопись. TRB написал рукопись. JMM интерпретировать данные, сделал критические интеллектуальные предложения, и рассмотрел рукопись. SMC интерпретировать данные, сделанные критические интеллектуальные предложения и рассмотрел рукопись.
Materials
| VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml sterile polypropylene tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16% formaldehyde solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BD FACS lysing solution (10X) | BD Biosciences | 349202 | Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C) |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Life technologies | 14190-144 | To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C) |
References
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
- Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
- Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
- Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. , (2016).
- Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
- Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
- Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
- Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
- Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
- Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
- Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
- Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
- Ziegler-Heitbrock, L. . Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. , 3-36 (2014).
- Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
- Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
- Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
- Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
- Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
- Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
- Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
- Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
- Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
- Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. , 1-12 (2015).
- Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection?. AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
- McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
- Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
- Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. , 80-90 (2016).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
- Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
- Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
- Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
- Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
- Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
- Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
- Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196 (11), 4437-4444 (2016).
