A Simple flowcytometriske metode til at måle glukoseoptagelse og Glucose Transporter Udtryk for Monocyt undergrupper i fuldblod
Summary
Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.
Abstract
Monocytter er medfødte immunceller, der kan aktiveres af patogener og inflammation forbundet med visse kroniske inflammatoriske sygdomme. Aktivering af monocytter inducerer effektorfunktioner og en ledsagende forskydning fra oxidativ til glycolytisk metabolisme, der er ledsaget af forøget glucosetransporter ekspression. Denne øgede glykolytisk stofskifte er også observeret for uddannet immunitet af monocytter, en form for medfødt immunologisk hukommelse. Selv om in vitro-protokoller undersøger glucosetransporter ekspression og glukoseoptagelse af monocytter er blevet beskrevet, er ingen blevet gennemgået af multi-parametrisk flowcytometri i fuldblod. Vi beskriver en multi-parametrisk flowcytometrisk protokol til måling af fluorescerende glucoseanalog 2-NBDG optagelse i fuldblod med total monocytter og den klassiske (CD14 ++ CD16 -), mellemprodukt (CD14 ++ CD16 +) og ikke-klassisk ( CD14 + CD16 ++) monocytsubpopulationer. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at undersøge glucosetransporter ekspression og glucoseoptagelse for totale monocytter og monocyt subpopulationer under homeostase og inflammatorisk sygdom, og kan let modificeres til at undersøge glucoseoptagelse til andre leukocytter og leukocytsubpopulationer inden blod.
Introduction
Monocytter er en vigtig del af den menneskelige medfødte immunsystem, der hurtigt mobiliseres til steder med infektion og inflammation 1. Aktivering af monocytter er kritisk for begrænsning akut skade ved patogener og er også central til patogenesen af flere kroniske sygdomme, herunder aterosklerose 2, kræft 3, og HIV 4,5.
Metabolismen af hvilende og aktiverede monocytter adskiller sig dramatisk, med hvilende monocytter udnytte oxidativ metabolisme og aktiverede monocytter udnytte glykolytisk metabolisme (dvs. gæring af glukose til lactat) 6. Aktivering af monocytter inducerer ekspressionen af glukose transportører, der giver mulighed for øget glukoseoptagelse for glykolytisk stofskifte 7. Monocyt glucosetransporter 1 (Glut1) er en sådan transportør opreguleres under aktivering og dets ekspression er blevet vist at føre til produktion af proinflammatoriske cytokiner i vitro og i fedtvæv af fede mus 8. Infektion af en monocytisk cellelinie ved Kaposis sarkom associeret herpesvirus fører til cellulær opregulering af Glut1 9, og vi viste for nylig, at en øget andel af Glut1 udtrykker monocytter under kronisk HIV-infektion er til stede under ubehandlet og antiretroviral kombinationsbehandling-behandlet infektion 10. Tilsammen viser disse undersøgelser, at glukoseoptagelse og glykolytisk metabolisme ved monocytter er vigtige aspekter af mange inflammatoriske sygdomme. Således at en simpel metode måle monocyt Glut1 ekspression og glucoseoptagelse under homøostase og inflammatorisk sygdom vil sandsynligvis være til nytte for en bred vifte af forskere.
Humane monocytter er heterogene, bliver består af tre adskilte delmængder, der kan undersøges ved differentiel udtryk for celleoverflademarkører CD14 og CD16 11,12. Klassiske monocytter udtrykker et højt niveau af CD14, men ikke udtrykker CD16 (CD14 ++ CD16 -), mellemliggende monocytter udtrykker et højt niveau af CD14 og en mellemliggende niveau af CD16 (CD14 ++ CD16 +), og ikke-klassisk monocytter udtrykker et lavt niveau af CD14 og et højt niveau af CD16 (CD14 + CD16 ++). Monocytter, som udtrykker CD16, betegnes CD16 + monocytter, hvilket sammenlignet med CD16 – monocytter har høj ekspression af inflammatoriske cytokiner og evnen til mere effektivt at præsentere antigener 13,14. Ca. 10% af monocytter udtrykker CD16 under homeostase med højere procenter observeret under inflammation 15. Monocyt subpopulationer er forbundet med visse sygdomstilstande og kunne være nyttige biologiske markører for sygdom og sygdomsprogression 16.
Vores mål var at identificere en metode, der kan måle glucosetransporter ekspression og glukoseoptagelse af humane monocytter og monocyt-subpopulationer i forhold så tæt på PHYsiological betingelser som muligt. Tidligere undersøgelser målte monocyt glukose transportør udtryk og glukoseoptagelse 17,18, selvom disse metoder undersøgt isolerede monocytter, der kan have ændret protein-ekspression i forhold til fysiologiske forhold 19, og ingen tidligere undersøgelse har undersøgt humane monocyt subpopulationer. Brug multi-parametrisk flowcytometri, beskriver vi en metode til at undersøge glukose transportør udtryk og optagelse af det fluorescerende glukose analog 2-NBDG med total monocytter og monocyt subpopulationer (baseret på CD14 og CD16-ekspression) inden hele umanipulerede blod.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her i detaljer en simpel metode til at undersøge glucosetransporter ekspression og fluorescerende glucose analog optagelse af monocyt- og monocyt-subpopulationer i fuldblod. Ved at vurdere 2-NBDG optagelse i fuldblod, denne teknik giver mulighed for betingelser svarende til dem in vivo. En tidligere undersøgelse undersøgte 6-NBDG optagelse i monocytter separeret fra helblod ved densitetscentrifugering 17. Men denne undersøgelse ikke undersøge monocyt subpopulationer og sepa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev finansieret af den australske Center for HIV og Hepatitis Virologi Research (ACH 2) og en 2010 udviklingsmæssig tilskud (CNIHR) fra University of Washington Center for AIDS Research (CFAR), en NIH finansieret program under award nummer AI027757 som støttes således NIH institutter og centre (NIAID, NCI, NIMH, Nida, NICHD, NHLBI, NIA). CSP er en modtager af CNIHR og ACH 2 tilskud. SMC er en modtager af en National Health og Medical Research Council of Australia (NHMRC) Principal Research Fellowship. Forfatterne takker bidraget til dette arbejde af den victorianske Operationel Support Infrastructure Program modtaget af Burnet Institute. Vi anerkender bistand fra Geza Paukovic og Eva Orlowski-Oliver fra AMREP flowcytometri Core Facility for flowcytometri uddannelse og teknisk rådgivning. Vi takker Angus Morgan for medier coaching og organisering af videoen skyde. Vores taknemmelighedtil Jesse Masson og Jehad Abdulaziz K. Alzahrani for lab bistand under videooptagelse. Vi takker de bestræbelser Dr. David Simar ved School of Medical Sciences, UNSW, Australien, der tilbydes kritisk metodologisk rådgivning. CSP takker www.nice-consultants.com til grafiske konsultationer.
Forfatternes BIDRAG:
CSP udtænkt projektet, designet og udført eksperimenter, analyseret og fortolket data, og skrev manuskriptet. JJA fortolket data og skrev manuskriptet. TRB skrev manuskriptet. JMM fortolket data, lavet kritiske intellektuelle forslag, og revideret manuskriptet. SMC fortolket data, lavet kritiske intellektuelle forslag og revideret manuskriptet.
Materials
| VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml sterile polypropylene tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16% formaldehyde solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BD FACS lysing solution (10X) | BD Biosciences | 349202 | Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C) |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Life technologies | 14190-144 | To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C) |
References
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
- Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
- Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
- Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. , (2016).
- Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
- Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
- Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
- Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
- Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
- Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
- Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
- Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
- Ziegler-Heitbrock, L. . Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. , 3-36 (2014).
- Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
- Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
- Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
- Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
- Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
- Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
- Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
- Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
- Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
- Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. , 1-12 (2015).
- Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection?. AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
- McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
- Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
- Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. , 80-90 (2016).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
- Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
- Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
- Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
- Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
- Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
- Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
- Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196 (11), 4437-4444 (2016).
