En enkel Flowcytometriske metode for å måle glukoseopptak og Glukose Transporter Expression for Monocyttnivåene subpopulasjoner i fullblod

Summary

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Abstract

Monocytter er medfødte immunceller som kan aktiveres av patogener og betennelse forbundet med visse kroniske inflammatoriske sykdommer. Aktivering av monocytter induserer effektorfunksjoner og samtidig skifte fra oksidativ til glycolytic metabolisme som er ledsaget av økt glukosetransportør uttrykk. Denne økte glykolytisk metabolisme er også observert for trent immunitet av monocytter, en form for medfødt immunologisk hukommelse. Selv om in vitro-protokoller som undersøker glukosetransportør ekspresjon og glukoseopptak ved hjelp av monocytter er blitt beskrevet, har ingen vært undersøkt ved hjelp av multi-parametriske flowcytometri i fullblod. Vi beskriver en multiparametrisk flowcytometrisk protokoll for måling av fluorescerende glukoseanalogen 2-NBDG opptak i fullblod ved å totale monocytter og den klassiske (CD14 CD16 ^{++ -),} intermediat (CD14 ⁺⁺ CD16 ⁺⁾ og ikke-klassiske ( CD14 ⁺ CD16 ⁺⁺⁾ monocyttersubpopulasjoner. Denne fremgangsmåten kan brukes til å undersøke glukosetransportør ekspresjon og glukoseopptak for de totale monocytter og monocytt-subpopulasjoner i løpet av homeostase og inflammatorisk sykdom, og kan lett modifiseres for å undersøke glukoseopptak av andre leukocytter og leukocytt-subpopulasjoner i blod.

Introduction

Monocytter er en hovedkomponent av det humane medfødte immunsystem som er raskt mobiliseres til områder for infeksjon og inflammasjon ^1. Aktivering av monocytter er kritisk for å begrense akutt skade av patogener og er også sentralt til patogenesen av en rekke kroniske sykdommer, blant annet aterosklerose ^{2, 3} kreft, HIV og ^4,5.

Metabolismen av hvile og aktiverte monocytter skiller seg dramatisk, med hvile monocytter utnytte oksidativ metabolisme og aktiverte monocytter utnytte glycolytic metabolisme (dvs. gjæring av glukose til laktat) ^6. Aktivering av monocytter induserer uttrykk for glukosetransportører som gjør det mulig for økt glukoseopptak for glycolytic metabolisme ^7. Monocytt glukosetransportør 1 (Glut1) er en slik transportør oppregulert under aktivering, og dets ekspresjon har vist seg å føre til produksjon av proinflammatoriske cytokiner i vitro og i fettvev av overvektige mus ^åtte. Infeksjon av en monocyttisk cellelinje ved Kaposis sarkom assosiert herpesvirus fører til cellulær oppregulering av Glut1 ^9, og vi nylig viste at ved kronisk HIV-infeksjon en økt andel av Glut1-uttrykke monocytter er til stede under ubehandlet og antiviral kombinasjonsbehandling behandlet infeksjon ^10. Samlet utgjør disse studiene viser at glukoseopptak og glycolytic metabolismen av monocytter er viktige aspekter av mange inflammatoriske sykdommer. Således, til en enkel fremgangsmåte måle monocytt- Glut1 ekspresjon og glukoseopptak i løpet av homeostase og inflammatorisk sykdom er sannsynlig å være til nytte for en lang rekke forskere.

Humane monocytter er heterogen, idet består av tre distinkte undergrupper som kan bli undersøkt ved differensiell ekspresjon av det celleoverflatemarkører CD14 og CD16 ^11,12. Klassiske monocytter uttrykker et høyt nivå av CD14, men uttrykker ikke CD16 (CD14 CD16 ^{++ -),} mellomliggende monocytter uttrykker et høyt nivå av CD14 og et mellomliggende nivå av CD16 (CD14 ⁺ CD16 ^++), og ikke-klassiske monocytter uttrykker et lavt nivå av CD14 og et høyt nivå av CD16 (CD14 ⁺ CD16 ^++). Monocytter som uttrykker CD16 er betegnet CD16 ⁺ monocytter, som sammenlignet med CD16 ^– monocytter har høy ekspresjon av inflammatoriske cytokiner og evnen til mer effektivt å presentere antigener ^13,14. Omtrent 10% av monocytter uttrykker CD16 under homeostase med høyere prosenter observert under betennelse ^15. Monocytter subpopulasjoner er forbundet med visse sykdomstilstander og kan være nyttige biologiske markører for sykdom og sykdomsutvikling ^16.

Vårt mål var å identifisere en metode som kan måle glukosetransportør uttrykk og glukoseopptak av humane monocytter og monocytter subpopulasjoner i forhold så nær grafisiological betingelser som mulig. Tidligere studier målt monocytter glukosetransportør uttrykk og glukoseopptak ^17,18, selv om disse metodene undersøkt isolerte monocytter som kan ha endret protein uttrykk i forhold til fysiologiske forhold ^19, og ingen tidligere studie har undersøkt menneskelige monocytter subpopulasjoner. Ved hjelp av multi-parametrisk flowcytometri, beskriver vi en metode for å undersøke glukosetransportør uttrykk og opptak av fluorescerende glukoseanalogen 2-NBDG av totalt monocytter og monocytter subpopulasjoner (basert på CD14 og CD16 uttrykk) i hele umanipulerte blod.

Protocol

MERK: HIV-smittet og HIV-infiserte pasienter ble rekruttert fra Infectious Diseases Unit ved The Alfred Hospital i Melbourne, VIC, Australia, og fra lokalsamfunnet, henholdsvis. Informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne, og forskningen ble godkjent av The Alfred Hospital Research and Ethics Committee. 1. Glut1 Cell Surface Detection på monocytter og Monocyttnivåene subpopulasjoner Samle blod i citrate ACD-B antikoagulerende rør og begynne eksperimentene i et biologis…

Representative Results

Kompensasjon må utføres for enkelte fluorokromer å hindre fluorescenslekkasjer. Monocytter er først beriket av gating basert på fremover og sidespredning. Tomtene som presenteres er representanter for minst seks uavhengige eksperimenter utført på fullblod fra seks eller flere deltakere som tidligere rapportert 10 Figur 1A viser innledende gating av monocytter på cellen scatter og utelukkelse av T-celler ved gating innenfor CD3 -. Befolkninge…

Discussion

Protokollen er beskrevet her detaljer en enkel metode for å undersøke glukosetransportør ekspresjon og fluoriserende analog glukoseopptak av monocytt og monocytt subpopulasjoner i helblod. Ved å vurdere 2-NBDG opptak i fullblod, kan denne teknikken for forhold som ligner de som in vivo. En tidligere studie undersøkte 6-NBDG opptak i monocytter separert fra fullblod ved sentrifugering tetthet ^17. Men denne studien ikke undersøke monocytt subpopulasjoner og separering av monocytter fra helblod po…

Materials

VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes	Greiner Bio-One GmbH	455094
5 ml sterile polypropylene tubes	BD Biosciences	352063
Albumin from Bovine Serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
16% formaldehyde solution	Electron Microscopy Science	15710
BD FACS lysing solution (10X)	BD Biosciences	349202	Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C)
anti-CD3-PE	BD Biosciences	555340
anti CD14-APC	BD Biosciences	555399
anti-CD16-PECy7	BD Biosciences	557744
anti-Glut1-FITC	R & D Systems	FAB1418F
IgG2b-FITC	R & D Systems	IC0041F
2-NBDG	Life technologies	N13195	Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X)	Life technologies	14190-144	To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C)