En enkel Flödescytometriska metod för att mäta glukosupptag och glukostransportör uttryck för monocyt Subpopulationer i helblod
Summary
Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.
Abstract
Monocyter är medfödda immunceller som kan aktiveras av patogener och inflammation i samband med vissa kroniska inflammatoriska sjukdomar. Aktivering av monocyter inducerar effektorfunktioner och en åtföljande övergång från oxidativ till glykolytiska metabolismen som är förenad med ökad glukostransportör uttryck. Denna ökade glykolytiska metabolismen observeras även för utbildad immunitet monocyter, en form av medfödd immunologiskt minne. Även in vitro protokoll undersöker glukostransportör uttryck och glukosupptag av monocyter har beskrivits, har ingen granskats av flera parametrisk flödescytometri i helblod. Vi beskriver en multi-parametrisk flödescytometrisk protokoll för mätning av fluorescerande glukos analog 2-NBDG upptag i helblod med totala monocyter och den klassiska (CD14 ++ CD16 -), mellan (CD14 ++ CD16 +) och icke-klassiska ( CD14 + CD16 ++) monocytsubpopulationer. Denna metod kan användas för att undersöka glukostransportör uttryck och glukosupptag för total monocyter och monocyt subpopulationer under homeostas och inflammatorisk sjukdom, och kan lätt modifieras för att undersöka glukosupptag för andra leukocyter och leukocyter subpopulationer inom blod.
Introduction
Monocyter är en viktig del av människans medfödda immunförsvaret som snabbt mobiliseras till ställen för infektion och inflammation en. Aktivering av monocyter är avgörande för att begränsa akut skada av patogener och är också centralt för patogenesen av flera kroniska sjukdomar, inklusive åderförkalkning 2, cancer 3, och HIV 4,5.
Metabolismen av vilande och aktiverade monocyter skiljer sig drastiskt, med vilande monocyter utnyttjar oxidativ metabolism och aktiverade monocyter använder glykolytiska metabolismen (dvs. jäsning av glukos till laktat) 6. Aktivering av monocyter inducerar uttryck av glukostransportörer som möjliggör ökad glukosupptag för glykolytiska metabolismen 7. Monocyt glukostransportör 1 (glut1) är en sådan transportör uppregleras under aktivering och dess uttryck har visat sig leda till produktion av proinflammatoriska cytokiner i vitro och i fettvävnad av feta möss 8. Infektion av en monocytisk cellinje genom Kaposis sarkom i samband herpesvirus leder till cellulär uppreglering av glut1 9, och vi visade nyligen att en ökad andel av glut1-uttryckande monocyter under kronisk HIV-infektion är närvarande under obehandlade och antiretroviral kombinationsbehandling behandlad infektion 10. Sammantaget visar dessa studier visar att glukosupptag och glykolytiska metabolismen av monocyter är viktiga aspekter av många inflammatoriska sjukdomar. Således, till en enkel metod för att mäta monocyt glut1 uttryck och glukosupptag under homeostas och inflammatorisk sjukdom kommer sannolikt att vara till nytta för ett brett spektrum av forskare.
Humana monocyter är heterogena, som består av tre olika undergrupper som kan granskas av differentiellt uttryck av cellytmarkörer CD14 och CD16 11,12. Klassiska monocyter uttrycker en hög nivå av CD14 men uttrycker inte CD16 (CD14 ++ CD16 -), mellan monocyter uttrycker en hög nivå av CD14 och en mellannivå av CD16 (CD14 ++ CD16 +), och icke-klassiska monocyter uttrycker en låg nivå av CD14 och en hög nivå av CD16 (CD14 + CD16 ++). Monocyter som uttrycker CD16 betecknas CD16 + monocyter, som jämfört med CD16 – monocyter har hög expression av inflammatoriska cytokiner och förmågan att mer effektivt presentera antigener 13,14. Ungefär 10% av monocyter uttrycker CD16 under homeostas med högre procenttal som observerats under inflammation 15. Monocyt subpopulationer är förknippade med vissa sjukdomstillstånd och kan vara användbara biologiska markörer för sjukdom och sjukdomsutveckling 16.
Vårt mål var att identifiera en metod som kan mäta glukostransportör uttryck och glukosupptag av humana monocyter och monocyt subpopulationer under förhållanden så nära physiological förhållanden som möjligt. Tidigare studier mätt monocyt glukostransportör uttryck och glukosupptag 17,18, men dessa metoder undersökte isolerade monocyter som kan ha förändrat proteinuttryck jämfört med fysiologiska betingelser 19, och ingen tidigare studie har undersökt humana monocyt subpopulationer. Med hjälp av multi-parametrisk flödescytometri, beskriver vi en metod för att undersöka glukostransportör uttryck och upptag av fluorescerande glukos analog 2-NBDG med totala monocyter och monocyt subpopulationer (baserat på CD14 och CD16 uttryck) inom hela omanipulerat blod.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här detaljer en enkel metod för att undersöka glukostransportör uttryck och fluorescerande glukos analog upptag av monocyter och monocyter subpopulationer i helblod. Genom att bedöma 2-NBDG upptag i helblod, tillåter denna teknik för förhållanden liknande dem in vivo. En tidigare studie undersökte 6-NBDG upptag i monocyter separerade från helblod genom densitetscentrifugering 17. Men denna studie undersöker inte monocyt subpopulationer och separation av monocyter …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning har finansierats av den australiensiska Centre for HIV och Hepatit Virology Research (ACH 2) och en 2010 utvecklings bidrag (CNIHR) från University of Washington Center for AIDS Research (CFAR), en NIH finansierat program under tilldelning nummer AI027757 som stöds med följande NIH institut och Centers (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP är en mottagare av CNIHR och ACH två bidrag. SMC är en mottagare av en National Health och Medical Research Council of Australia (NHMRC) Principal Research Fellowship. Författarna erkänner tacksamt bidrag till detta arbete av den viktorianska operativa Infrastruktur Support Program emot av Burnet Institute. Vi erkänner hjälp av Geza Paukovic och Eva Orlowski-Oliver från Amrep Flow Cytometry Core Facility för flödescytometri utbildning och teknisk rådgivning. Vi tackar Angus Morgan för media coaching och organisation av videoinspelning. vår tacksamhetJesse Masson och Jehad Abdulaziz K. Alzahrani för lab bistånd under videoinspelning. Vi tackar ansträngningar Dr David Simar vid Institutionen för medicinska vetenskaper, UNSW, Australien som erbjuder kritisk metodrådgivning. CSP vill tacka www.nice-consultants.com för grafiska samråd.
Författarnas BIDRAG:
CSP tänkt projektet utformas och utfört experiment, analyseras och tolkas data och skrev manus. JJA tolkade uppgifter och skrev manuskriptet. TRB skrev manuskriptet. JMM tolkade data gjorde kritiska intellektuella förslag, och granskade manuskriptet. SMC tolkade data gjorde kritiska intellektuella förslag och granskade manuskriptet.
Materials
| VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml sterile polypropylene tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16% formaldehyde solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BD FACS lysing solution (10X) | BD Biosciences | 349202 | Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C) |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Life technologies | 14190-144 | To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C) |
References
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
- Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
- Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
- Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. , (2016).
- Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
- Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
- Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
- Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
- Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
- Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
- Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
- Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
- Ziegler-Heitbrock, L. . Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. , 3-36 (2014).
- Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
- Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
- Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
- Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
- Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
- Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
- Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
- Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
- Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
- Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. , 1-12 (2015).
- Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection?. AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
- McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
- Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
- Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. , 80-90 (2016).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
- Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
- Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
- Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
- Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
- Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
- Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
- Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196 (11), 4437-4444 (2016).
