Summary
We beschrijven hier een eenvoudige en snelle papieren DNA extractiewerkwijze HIV provirale DNA uit vol bloed gedetecteerd met kwantitatieve PCR. Dit protocol kan worden verlengd voor gebruik bij het detecteren andere genetische merkers of alternatieve amplificatiewerkwijzen.
Abstract
FINA, filtratie isolatie van nucleïnezuren, is een nieuwe extractie methode die gebruik maakt van verticale filtering via een scheidingsmembraan en absorberend kussen cellulaire DNA uit volbloed extract in minder dan 2 minuten. Het bloedmonster wordt behandeld met detergens, kort gemengd en pipet aangebracht op het scheidingsmembraan. Het lysaat transporteert in de blotting pad door capillaire werking, het vastleggen van het genomische DNA op het oppervlak van het scheidingsmembraan. Het geëxtraheerde DNA wordt vastgehouden op het membraan tijdens een eenvoudige wasstap waarin PCR-remmers zijn goddelozen in het absorberende blotting pad. Het membraan dat de ingevangen DNA wordt vervolgens toegevoegd aan de PCR-reactie zonder verdere zuivering. Deze eenvoudige methode vereist geen laboratorium uitrusting en kunnen eenvoudig worden geïmplementeerd met goedkope laboratorium benodigdheden. Hier beschrijven we een protocol voor zeer gevoelige detectie en kwantificering van HIV-1 provirale DNA van 100 gl volbloed als model voor beginFant diagnose van HIV die gemakkelijk kan worden aangepast aan andere genetische doelwitten.
Introduction
Verschillende rapporten hebben de ontwikkeling van papier- of een membraan extractiemethoden voor gebruik behandeld in point-of-care (POC) inrichtingen 1-5 met als doel de uitstekende gevoeligheid en specificiteit van moleculaire diagnostiek voor alle. De World Health Organization (WHO) Seksueel Overdraagbare Aandoeningen Diagnostics initiatief bedacht de term VERZEKERD (Betaalbaar, gevoelig, specifiek, Gebruiksvriendelijk, Snel en Robuust, Apparatuur-vrij en geleverd aan degenen die het nodig hebben) om te beschrijven de ideale kenmerken van een POC -test 6. Van deze richtlijnen, de apparatuur-vrije eigenschap is bijzonder moeilijk te bereiken voor moleculaire diagnostiek. Toch zal elke innovatie op het gebied van de doelstelling van het bereiken van die in de meeste behoefte te bevorderen, en er is hoop voor verbeteringen op korte termijn in testprestaties door aanpassing van bestaande technologie 7.
Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het extraheren van DNA uit vol bloeddat betekent complexe chemie of laboratorium instrumentatie niet nodig. De FINA (filtratie isolatie van nucleïnezuren) monstervoorbereiding methode werd oorspronkelijk ontwikkeld om leukocyt DNA uit volbloed extraheren om de HIV-1 provirus detecteren van een monster te beantwoorden point-of-care (POC) kwantitatieve PCR (qPCR) vroeg zuigeling diagnostische (EID) platform voor gebruik in beperkte resource-instellingen 8-11. FINA extractie verschilt van conventionele zuiveringsmethoden die silicamembranen of met siliciumdioxide beklede paramagnetische deeltjes om reversibel binden van DNA in de aanwezigheid van chaotrope middelen 12. In plaats daarvan gebruikt FINA verticale filtratie via een scheidingsmembraan om cellulaire DNA uit volbloed direct extraheren. Het membraan dat de ingevangen DNA kan direct in een PCR-buis en ofwel direct gebruikt in een PCR-reactie of lucht gedroogd latere amplificatie 9. Nr chaotrope middelen, fenol, of alcoholen gebruikt in de monstername, EliminaTing het uitgebreid wassen stappen die nodig zijn om krachtige qPCR remmers afgeleid van het extractieproces 13,14 verwijderen.
De FINA membraan kan zowel cellen 9 of genomisch DNA vrijgemaakt door cellysis 11 voordat het monster wordt toegevoegd aan het membraan vast te leggen. Voor de cel opname, wordt bloed direct toegevoegd aan het membraan. De cellen worden vervolgens in het membraan gelyseerd door toevoeging van 10 mM NaOH. Het voordeel van deze methode is dat het gaat slechts 3 stappen: 1) toevoegen van het monster; 2) cellysis / was en 3) filter disk plaatsing in qPCR buis. Het nadeel van deze methode is dat het membraan slechts een bepaald aantal cellen direct evenredig met de diameter van de membraanschijf kan bevatten. De detectielimiet vereist voor EID bereikt, wordt 100 gl volbloed vereist voor monster ingang die een filter die te groot in een qPCR buis geplaatst meebrengt. Lyseren van de bloedcellen met detergent voor het toevoegen van het monster aan de collectiemembraan ligt een verwerkingsstap, maar maakt het gebruik van een kleinere filter voor dezelfde steekproef. We konden hoge reproduceerbaarheid, enkel exemplaar detectie en kwantificering van slechts 10 kopieën van HIV-1 provirale DNA van 100 pl bloed af met de testconfiguratie 11 tonen.
In dit rapport beschrijven we de FINA protocol zoals oorspronkelijk ontwikkeld voor gebruik in het laboratorium. Het membraan / filter sandwich zogenaamde FINA monstervoorbereiding module kunnen worden bereid in grote partijen en opgeslagen voor later gebruik. Wanneer specimens worden geëxtraheerd dit duurt 2 min en kunnen worden uitgevoerd in verschillende grootte batches. De qPCR kan onmiddellijk worden uitgevoerd of de filters die de ingebedde DNA kan worden opgeslagen totdat het handig om qPCR voeren. Deze methode is erg handig voor routine-analyse van monsters in zowel lage als hoge resource-instellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek statement: De gehele bloedmonsters die in deze studie worden niet beschouwd als onderzoek waarbij menselijke proefpersonen zijn. De monsters werden verkregen voor klinische diagnostische doeleinden, die zijn voldaan en het resterende gedeelte van deze monsters werd bepaald de FINA onderzoekstest. De monsters werden zodanig dat de onderzoekers waren niet in staat om de identiteit van personen gemakkelijk vaststellen gecodeerd.
1. Voorbereiding van de FINA Monstervoorbereiding Module
- Bereid vloeipapier pad door het snijden van een 35 x 35 mm 2 van een 2,6 mm dik 100% katoen pad. Snijd één pad per exemplaar.
- Bereid plastic paraffine folie met een papieren beschermlaag door een snij stuk paraffine film (25 mm (h) van 50 mm (w)) en vervolgens ponsen een gat 7,14 mm diameter in het midden van de band met een hamer aangedreven perforator. Bereid een tape per exemplaar.
- Bereid een gebonden glas bloed separator membraan (capture membraan) disk door ponsen een cirkel met een diameter van 8,35 mmmet een hamer gedreven perforator. Punch één schijf per exemplaar. De schijf heeft een partikelretentie vermogen van 2,3 urn.
- Monteer de FINA monstervoorbereiding module door het plaatsen van de vangst schijf in het midden van de blotting pad met behulp van een tang. Plaats de paraffine film tape over de vangst schijf, zodat het gat van de paraffine band verlaat het centrum van de vangst schijf blootgesteld.
- Zorgen voor maximaal contact tussen de schijf en de blotting pad door het uitrekken van de paraffine tape iets naar blotting pad te dekken en stevig indrukken van de paraffine tape te houden aan de blotting pad om alle randen van de schijf.
- Maak zoveel modules, dat bij experiment of voorraad voor toekomstig gebruik.
2. Voorbereiding van de qPCR Tube
- Bereid een 5,1 mm schijf tape dat de cel vangen membraan verankeren aan de zijkant van de buis te voorkomen qPCR het membraan blokkeert de fluorescentiedetectie door ponsen een cirkel dubbel beklede polyester de diagnostische tape met een hamer gedreven punch uit een plaat van de band. Bereid een tape schijf per exemplaar.
- Verwijder de ene kant van de sticker liner van de tape. Plaats de tape in een 200 ui PCR tube, plakken het op één zijde en naar de bodem van de buis. Verwijder de tweede sticker liner. De buis is nu klaar om voorbereid schijf te ontvangen.
- Produceren vele buizen, dat bij experiment of voorraad voor toekomstig gebruik.
3. Contrive Blood Specimen
Let op: Als een echt monster wordt voorbereid, ga dan naar stap 4.
- Dooi 8E5-LAV cellen 15 herbergen een enkele kopie van het HIV-1 provirus verkregen uit de Virologie Quality Assurance Laboratory (VQA; Rush Presbyterian / St Luke's Medical Center, Chicago, IL.).
Opmerking: Deze worden opgeslagen als bevroren celpellets in een concentratie van 4000 cellen / ul. Celgetal werd geverifieerd zoals eerder 9 beschreven. - Bereid serial verdunning in invriesmedium (90% foetaal runderserum, 10% dimethylsulfoxide) concentraties variërend 1-400 cellen / ul.
- Pipet 10 pi cellen uit elk van de seriële verdunningen in een microcentrifugebuis. Voeg 100 ul van verse HIV-1 negatieve EDTA behandeld volbloed monster aan elke buis om een standaard curve van 8E5-LAV kopie nummers 10-4,000 creëren. Meng door voorzichtig flicking de bodem van de buis 5 maal.
4. Voer FINA Extraction
- Lyse bloedcellen door het toevoegen van Triton-X100) tot een uiteindelijke concentratie van 1% (11 ui 10% Triton-X100 bij 110 gl volbloed en cellen uit stap 3.3).
- Meng door voorzichtig flicking de bodem van de buis 5 maal. Het bloed moet doorzichtig rood.
- Pipet al het bloedmonster op de vangst schijf.
Opmerking: Een waterdichte afdichting tussen de paraffine tape en de vangst membraan zorgt ervoor dat het bloed stroomt door het membraan, en een goed contact tussen de vangst membrane en deppen pad montage zorgt voor een snelle steekproef wicking. - Laat het monster om te genieten door het filter.
Opmerking: Het bloed lysaat wieken in het blotting pad door capillaire werking, het vastleggen van het genomische DNA op het oppervlak van de schijf opname. Het lysaat is gedrenkt in de disk als het mat verschijnt. - Voeg 600-1000 pi 10 mM NaOH druppelsgewijs op de vangst schijf.
Opmerking: De wasbuffer kan ook worden toegevoegd als een bulk toevoeging van 600 pi. De buffer zal een druppel op de hydrofobe paraffine band vormen en lont door het gat om de schijf ongeveer 20 sec. Het filter zal veranderen van rood naar wit te geven klaring van hemoglobine. - Scheid de schijf uit het pad blotting met een pincet en de schijf gelden voor de band in de bereide PCR buis. Als er een rode kleur op het filter voeg 50-100 ul wasbuffer het filter te verwijderen alvorens deze in het buisje.
Let op: Zelden overdruk toegepast tijdens de bereiding vande FINA modules resulteert in een verdeling van het membraan lagen tijdens scheiding van de blotting pad. Gooi deze schijven en voor te bereiden een vers monster. - Nadat het filter is geplaatst in de PCR-buis, analyseert de monsters meteen. Als alternatief, droge overnachting in een doos met calciumsulfaat droogmiddel, dan de dop en plaats in een folie zakje met silica droogmiddel en op te slaan totdat klaar voor analyse.
5. qPCR Reaction
- Bereid 100 pi qPCR master mix per reactie met behulp van HIV specifieke primers en sondes zoals eerder beschreven 9,11. Een in- amplificatiecontrole te controleren op de aanwezigheid van remmers en amplificatie te verifiëren dat een negatief monster een echte negatieve. Wees er zeker van dat filter volledig bedekt is met master mix en dat het filter blijft bevestigd naar de andere kant van de buis tijdens de gehele reactie.
- Amplificatie uit te voeren met een real-time PCR inrichting zoals hierboven beschreven 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De workflow voor het extraheren van proviraal DNA uit vol bloed waaraan 8E5-LAV-cellen wordt getoond in Figuur 1. Figuur 2 toont de FINA monster module en bereid qPCR buis. Deze werkwijze maakt efficiënte amplificatie van HIV-1 provirus van 8E5-LAV cellen bij verschillende kopie-aantallen, zoals in de standaardcurve van gezochte monsters (figuur 3). PCR had een rendement van 103%, zoals berekend uit effect = -1 + 10 (-1 / helling). Vergelijking van de lijn was y = -3.25x + 27,95, met een correlatie van R² = 0,996. De HIV provirale DNA standaardcurve repliceert ook zeer reproduceerbare amplificatie, zoals blijkt uit tabel 1. Daarnaast wordt een interne controle van 500 exemplaren Hydroxypyruvate reductase aanwezig is te laten zien dat er geen PCR remming verkregen uit extractie bloed met FINA, ongeacht het aantal kopieën van HIV-1 provirus aanwezig (Figuur 4). IC amplificatie was efficiënt verkregen in alle 18 geteste monsters met een gemiddelde Cq van 21,92 ± 0,25 en een CV van 1%.
Figuur 1: Workflow voor het detecteren van provirale DNA uit vol bloed verrijkt met 8E5-LAV cellen qPCR. (A) van links naar rechts, de bereide FINA module, nadat bloed toegevoegd aan de opname membraan en na wasbuffer werd toegevoegd. (B) qPCR buisjes met capture schijven vast aan dubbel gecoat tape met qPCR master mix toegevoegd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: FINA in-house-module en qPCR buis voorbereiding. (A) een 8,35-mm diameter capture membraanschijf werd tussen een vierkant 707 blotting pad en een dunne laag paraffine tape met een 7,14 mm diameter gat in het midden, zodat de opening van de paraffine band werd gecentreerd op de vangst schijf voor de directe toepassing van gelyseerd bloed met pipet. (B) A 5.1 mm dubbel gecoat polyester diagnostische tape zit vast aan de zijkant van 200 ul qPCR buis. De tweede bekleding van de tape wordt verwijderd om kleverige oppervlak bloot te stellen voor de toepassing van capture schijf als u klaar bent. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Standaard curve van HIV-1 provirale DNA bedacht monsters (A) Amplificatie plots verkregen uit 100 pl 4 replicaten HIV-1 negatieve volbloed verrijkt met 4000, 400, 40 en 10 8E5-LAV cellen met 500 kopieën / reactie van de interne controle Solid lijnen = versterking percelen; Gestippelde lijn = drempel. Y-as fluorescentie-eenheden en X-as is qPCR cyclusnummer. (B) Standaard curven van Cq waarden berekend uit amplificatie plot versus log aantal kopieën van 8E5-LAV cellen per 100 pl volbloed. Vergelijking van de lijn: y = -3.25x + 27.95; R² = 0,996; PCR-efficiëntie = 103,23% berekend via Rendement = -1 + 10 (-1 / helling) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Interne controle geeft geen qPCR remming 500 exemplaren Hydroxypyruvate reductase Amplification Control Plasmid toegevoegd per reactie.. solidelijnen = versterking percelen; Gestippelde lijn = drempel. Gemiddeld Cq van IC = 21,92 ± 0,25. CQS varieerde 21,21-22,32. Coëfficiënt van variatie (CV%) = 1%; N = 18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| 8E5-LAV cellen / | |||
| 100 pl WB | Ave. Cq | SD | CV (%) |
| 4000 | 16.27 | 0.14 | 1 |
| 400 | 19.54 | 0.15 | 1 |
| 40 | 22.56 | 0.3 | 1 |
| 10 | 24.83 | 0.15 | 1 |
Tabel 1: Gemiddelde Cq, standaarddeviatie (SD) en de variatiecoëfficiënt (CV%) van 4000, 400, 40 en 10 kopieën van 8E5-LAV standaardcurve FINA extractie en HIV-1 specifieke primers en sondes. N = 4. WB = volbloed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EID gekoppeld aan een snelle behandeling toegang is aangetoond kindersterfte verminderen door HIV infectie 16. Vanwege de aanhoudende maternale antilichamen in het bloed van een kind, zijn snelle HIV antilichamentests beperkt nut bij het bepalen van de status van HIV-blootgestelde zuigelingen. De WHO beveelt aan dat alle baby's van HIV-1-positieve moeders moeten worden getest bij 4-6 weken oud, met een virologisch onderzoek 17. We hebben gemeld de ontwikkeling van een test voor de detectie en kwantificering van HIV-1 provirale DNA in gehele bloedmonsters die in staat enkele kopie detectie met bewezen 100% gevoeligheid en specificiteit in een klein gebied van evaluatie 61 Nederlandse zuigelingen 11 is. Honderd microliter of meer van volbloed kan worden verzameld via vingers of hiel stick en verwerkt via de FINA modules 18,19. Deze bloedmonsters kunnen vervolgens worden opgeslagen gedurende ten minste één maand voor amplificatie waardoor deze methode ideal voor het testen van zuigelingen die verre van laboratoria.
In de studie beschreven in figuur 3, een standaardcurve van gezochte monsters van HIV-1 negatief geheel bloed waaraan ontdooide cellen die HIV-1 provirale DNA afgebeeld. Een nadeel aan dit onderzoek is dat sommige cellen toegevoegd aan het monster reeds kunnen gelyseerd door het invriezen / ontdooien, die mogelijk het detectieniveau van het doel kunnen worden verbeterd. Een strengere experimenteel design zou zijn geweest het monster met behulp van vers gekweekte cellen, die beter zou zijn nagebootst volbloed te hebben bedacht.
De FINA monster prep methode is ontworpen voor inbouw in een EID POC qPCR apparaat (in ontwikkeling) voor gebruik in beperkte hulpbron instellingen 8; echter, kan de handleiding format hier beschreef ook een nuttige aanvulling op sample prep portfolio een laboratorium te zijn. FINA maakt geen gebruik van de bind, wassen en elueren strategie gebruikt in dried bloedvlekken en ander op papier gebaseerde extractie systemen die de onttrokken nucleïnezuren verdunt, wat mogelijk kan leiden tot sub-optimale detectiegevoeligheid 5. Het FINA systeem is zeer flexibel en kan gemakkelijk worden aangepast voor andere genetische tests naast proviraal HIV DNA detectie. Lagere hoeveelheden bloed of andere biologische monsters kunnen worden verwerkt voor overvloedige doelen en hogere volumes die minder overvloedig. In onze eerste uitvoeringsvorm van het systeem FINA, we vangen de cellen uit bloed met behulp van een bloedscheidingsysteem membraan en vervolgens lyseren ze door de toevoeging van 10 mM NaOH 9. Deze uitvoering heeft het voordeel van een minder bedieningsstappen, maar het celaantal / bloedvolume die kunnen worden verwerkt kleiner. Naast de gebonden glasmembraan in dit rapport, zijn andere bloedscheiding of bloedafname filtreerpapier succes gebruikt bij deze werkwijze en verschillende kwantitatieve PCR instrumenten ook aangetoond dat template ingebed in de f amplificerenIlter schijf 9. De enige voorwaarde is dat het filter de fluorescentie lezen van de real-time PCR instrument niet blokkeert.
Een belangrijke beperking van FINA extractie is dat er een grootte beperking van de diameter van de vangst membraan. Een schijf met een membraan groter dan 9 mm kan in een 200 ul qPCR buis worden gebracht zonder het membraan overlapping in de buis waarin het oppervlak blootgesteld aan het reactiemengsel beperkt. Bovendien, hoe groter de schijf diameter, hoe qPCR reactievolume moet de filter die de kosten verhoogt dekken en los- en tijd van de test. Als het filter te klein om het DNA in het monster efficiënt vangen, kan het voorkomen van verstoppen efficiënt wassen.
Met de gebonden glas capture membraan, konden we alleen HIV-1 provirale DNA en viraal RNA niet vangen monsters volbloed (gegevens niet getoond). We weten niet of alternatieve membranen of buffers kunnen worden gebruikt to bevorderen isolatie van RNA in plaats van of naast DNA. Als de lezer wil DNA uit het monster te isoleren enige dit protocol niet de enzymatische verwijdering van RNA vereist voor bepaalde protocollen vereisen. Detecteren van zowel HIV-1 RNA en DNA in klinische monsters zou de gevoeligheid van MI en dit gebrek aan RNA detectie te verbeteren is een beperking van onze diagnostische test.
De meest cruciale stap in het aanpassen van FINA proces om een nieuwe test bepaalt de omvang van het filter te valideren de hoeveelheid DNA, dat wil zeggen, het aantal cellen geschikt in het monster te testen. Algemeen FINA extractie werkt het beste exemplaren met kleinere aantallen cellen zodat kleinere capture schijven kan worden gebruikt. Om het bindend vermogen van het filter te bepalen, een tweede filter schijf simpelweg toevoegen aan de FINA module onder de collectie membraan gestapeld. Voeg het monster en was de membranen als in de stappen 4,1-4,5. Plaats elk van de DNA-capture schijven in afzonderlijke qPCR buizen en amplify. Met behulp van een standaardcurve, bepaalt het percentage van de input DNA gevangen op elke filter. De grootte van het filter kan worden geoptimaliseerd voor het type van de test. Voor de FINA provirale DNA test hier beschreven, wordt meer dan 99% van humaan genomisch DNA vastgelegd wanneer cellysaat wordt toegevoegd aan het filter (ongepubliceerde waarnemingen) waardoor superieure detectiemogelijkheden.
Naast EID, zouden toekomstige toepassingen van FINA onder de detectie en kwantificering van proviraal DNA als een biomarker voor HIV-1 ziekte controle bij patiënten die virale suppressie bereikt door antiretrovirale therapie. De behandeling ter controle HIV uitroeiing kan uitgevoerd worden door andere ingangen naast perifeer bloed voor reservoirs van HIV-1 geïnfecteerde cellen. Provirale HIV test kan ook worden gebruikt om vaccinproef onderwerpen infectiestatus screenen. De bloedmonsters zijn stabiel tijdens opslag op FINA modules en kunnen worden verzameld onder veldomstandigheden voor latere verzending naar central laboratoria voor PCR analyse maken van deze methode ideaal voor epidemiologische studies. Naast HIV-1 detecteren, kan dit zeer flexibele werkwijze ook worden gebruikt om nauwkeurig geneesmiddel doelwitten in biologische monsters farmacogenomica screening of andere SNP detectie en genotypering voor snelle diermodellen versterken. Isothermische amplificatiewerkwijzen zoals helicase afhankelijke amplificatie (HDA) of lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) kan ook worden gebruikt met FINA geëxtraheerd sjabloon of het DNA ingesloten op het filter kan worden gebruikt als template voor conventionele PCR amplificatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
- Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper Machine" for Molecular Diagnostics. Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
- Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).
- Linnes, J. C., et al.
- Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).
- Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward. Sex Transm Infect. 82, Suppl 5 1-6 (2006).
- Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D.
- Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).
- Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR. J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).
- Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. , (2012).
- McFall, S. M., et al. A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR. Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
- Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. , (1991).
- Violari, A., et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).
- World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2010).
- Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
- Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).
