JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Genetics

En robot platform for High-throughput protoplastisolering og Transformation

Published: September 27, 2016
doi:
10.3791/54300
, ,
1Department of Plant Sciences,University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Renewable Carbon,University of Tennessee, Knoxville, 3Department of Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering,University of Tennessee, Knoxville

Summary

En høj-throughput, automatiseret, tobak protoplast produktion og transformation metodik er beskrevet. Det robotsystem giver massivt parallelle genekspression og opdagelse i modellen BY-2-systemet, der bør være oversættes til ikke-model afgrøder.

Abstract

I det sidste årti har der været en genopblussen i brugen af ​​planteprotoplaster, der spænder fra modelarter at beskære arter, til analyse af signaltransduktionsveje, transkriptionelle regulatoriske netværk, genekspression, genom-redigering og gendæmpning. Endvidere er der gjort betydelige fremskridt i regenerering af planter fra protoplaster, der har genereret endnu mere interesse for brugen af ​​disse systemer til plantegenomik. I dette arbejde har en protokol udviklet til automatisering af protoplast isolation og transformation fra en 'Bright Yellow »2 (BY-2) suspension tobak kultur ved hjælp af en robot platform. De transformationsprocedurer valideret ved anvendelse af en orange fluorescerende protein (OFP) reportergen (pporRFP) under kontrol af blomkålsmosaikvirus 35S-promotoren (35S). OFP ekspression i protoplaster blev bekræftet ved epifluorescens-mikroskopi. Analyser omfattede også protoplast produktion effektivitet metoder ved hjælp propidium iodid. Endelig blev lavpris fødevarekvalitet enzymer anvendes til protoplastisolering procedure, omgår behovet for lab-grade enzymer, som er omkostnings-prohibitivt i high-throughput automatiseret protoplastisolering og analyse. Baseret på den protokol udviklet i dette arbejde, kan udføres hele proceduren fra protoplast isolation til transformation i under 4 timer, uden input fra operatøren. Mens den protokol udviklet i dette arbejde blev valideret med BY-2 cellekultur, bør de procedurer og metoder være oversættes til enhver plante suspension kultur / protoplast system, som skal gøre det muligt acceleration afgrøde genomforskning af.

Introduction

I de senere år har der været en betydelig drivkraft placeret på udformningen af transgene afgrøder til at overvinde forskellige sygdomme 1, udstyre herbicidresistens 2, tillægger tørke 3,4 og salt tolerance 5, forebygge herbivory 6, øge biomasse udbytte 7, og mindske cellevæg vrangvillighed 8. Denne tendens er blevet hjulpet på vej af udviklingen af nye molekylære værktøjer til at generere transgene planter, herunder genom-redigering ved hjælp CRISPR og Talens 9, og gen silencing gennem dsRNA 10, miRNA 11, og siRNA 12. Mens disse teknologier har forenklet frembringelsen af ​​transgene planter, har de også skabt en flaskehals, hvor der genereres ikke kan screenes under anvendelse af traditionelle systemer, der er afhængige af planteregenerering det store antal af transgene planter. Relateret til dette flaskehals, mens silencing og genom-redigering konstruktioner kan indføres hurtigt i planter, mange af demålrettede træk undlader at frembringe den ønskede virkning, som ofte først opdages planter analyseres i drivhuset. I dette arbejde har vi udviklet en metode til hurtig, automatiseret, high-throughput screening af planteprotoplaster, specifikt at afhjælpe den nuværende flaskehals i tidlig screening af store antal af genom-redigering og gene silencing mål.

Anvendelsen af ​​protoplaster, i modsætning til intakte planteceller, har flere fordele for udviklingen af ​​en automatiseret platform. Først protoplaster isoleret efter fordøjelse af plantecellevægge, og med dette ikke længere til stede barriere, er transformationseffektivitet steg 13. I intakte planteceller er der kun to veletablerede fremgangsmåder til transformation, biolistics 14 og Agrobacterium-medieret transformation 15. Ingen af ​​disse metoder kan let oversættes til flydende håndtering platforme, som biolistik kræver specialudstyr til transfoinger, hvorimod Agrobacterium-medieret transformation kræver co-kultur og efterfølgende fjernelse af bakterierne. Hverken er modtagelige for høj kapacitet metoder. I tilfælde af protoplaster, er transformation rutinemæssigt udført under anvendelse af polyethylenglycol (PEG) -medieret transfektion 16, som kun kræver flere løsning udvekslinger, og er ideelt egnet til håndtering af flydende platforme. For det andet, protoplaster, per definition, er single-cellekulturer, og dermed problemerne med sammenklumpning og kæde-dannelse i plantecellekulturer er ikke observeret i protoplaster. Med hensyn til hurtig screening under anvendelse af en plade-baseret spektrofotometer, sammenklumpning af celler, eller celler i flere planer vil føre til vanskeligheder med at erhverve konsekvente målinger. Da protoplaster er også tættere end deres dyrkningsmedier, de sedimentere til bunden af ​​brøndene, der danner et monolag, der er befordrende for plade-baseret spektrofotometri. Endelig mens plantecelle suspensionskulturer er Primarily afledt af callus 17, kan protoplaster høstes fra en række plantevæv, hvilket fører til muligheden for at identificere vævsspecifik ekspression. For eksempel, evnen til at analysere rod- eller blad-specifik ekspression af et gen kan være meget vigtigt at fænotype forudsigelse. Af disse grunde blev de protokoller, der er udviklet i dette arbejde valideret ved hjælp af protoplaster isoleret fra den udbredte tobak (Nicotiana tabacum L.) 'Bright Yellow »2 (BY-2) suspension kultur.

BY-2 suspensionskultur er blevet beskrevet som "HeLa" celle af højere planter, på grund af sin allestedsnærværende anvendelse i molekylær analyse af planteceller 18. For nylig, AF-2-celler er blevet anvendt til at undersøge virkningerne af plante stressfaktorer 19-22, intracellulært protein lokalisering 23,24, og grundlæggende cellebiologi 25-27 demonstrerer den brede anvendelighed af disse kulturer i plantebiologi. En yderligere fordel ved BY-2-kulturer ermulighed for at synkronisere kulturerne med aphidicolin, hvilket kan føre til øget reproducerbarhed for genekspressionsstudier 28. Endvidere er der udviklet metoder til udvinding af BY-2 protoplaster ved anvendelse lavpris enzymer 29,30, som enzymer, der traditionelt anvendes til generering af protoplaster er omkostningseffektive uoverkommelige for højt gennemløb systemer. Som sådan har den nedenfor beskrevne protokol blevet valideret ved anvendelse af BY-2 suspensionskultur, men det bør kunne ændres til en celle suspension plante kultur. Proof-of-concept eksperimenter udføres under anvendelse af en orange fluorescens protein (OFP) reportergen (pporRFP) fra de hårde koraller Porites porites 31 under styring af CaMV 35S-promotoren.

Protocol

1. Etablering af Suspension Cell Cultures Forbered væske BY-2-medier ved tilsætning 4,43 g Linsmaier & Skoog Basal medier, 30 g saccharose, 200 mg KH 2 PO 4, og 200 ug af 2,4-D (2,4-D) til 900 ml destilleret vand og pH til 5,8 med 0,1 M KOH. Efter indstilling af pH, justere slutvolumen til 1000 ml med destilleret vand og autoklave. Medier kan opbevares op til 2 uger ved 4 ° C. Inokulere en 250 ml Erlenmeyer-kolbe med 100 ml flydende BY-2-medier og et enkelt stykke BY-2 c…

Representative Results

I den aktuelle undersøgelse, den fordobling på BY-2 varierede fra 14-18 timer afhængig af temperaturen, hvorved kulturerne blev inkuberet, i overensstemmelse med tidligere rapporter om en gennemsnitlig cellecykluslængden af ​​15 timer. Med denne fordobling sats, en 1: blev 100 startende inokulum anvendes til at initiere kulturer, hvilket fører til kulturer med en pakket cellevolumen (PCV) på 50% i 5-7 dage. I den nuværende protokol, hvori kulturer blev dyrket i 200 ml medium, …

Discussion

Den ovenfor beskrevne protokol er blevet valideret for protoplast isolation, tælling, og transformation ved hjælp af BY-2 tobak suspension cellekultur; kunne dog protokollen let udvides til enhver plante suspension kultur. På nuværende tidspunkt har protoplast isolation og transformation er opnået i en lang række planter, herunder majs (Zea mays) 10, gulerod (Daucus carota) 32, poppel (Populus euphratica) 33, drue (Vitis vinifera) 34, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by Advanced Research Projects Agency – Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

Materials

Orbitor RS Microplate mover Thermo Scientific
Bravo Liquid Handler Agilent
Synergy H1 Multi-mode Reader BioTek
MultiFlo FX Multi-mode Dispenser BioTek
Teleshake Inheco 3800048
CPAC Ultraflat Heater/cooler Inheco 7000190
Vworks Automation Software Agilent Software used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum Software Thermo Scientific Task scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 Software Biotek Software used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted Microscope Olympus
Zyla 3-Tap microscope camera Andor
ET-CY3/TRITC Filter Set Chroma Technology Corp 49004
Rohament CL AB Enzymes sample bottle low-cost cellulase
Rohapect UF AB Enzymes sample bottle low-cost pectinase
Rohapect 10L AB Enzymes sample bottle low-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal Medium Phytotechnology Laboratories L689
2,4 dichlorophenoxyacetic acid Phytotechnology Laboratories D295
propidium iodide Sigma Aldrich P4170
Poly (ethylene glycol) 4000 Sigma Aldrich 95904-250G-F Formerly Fluka PEG
Propidium Iodide Fisher Scientific 25535-16-4 Acros Organics
CaCl2 Sigma Aldrich C7902-1KG
Sodium Acetate Fisher Scientific BP333-500
Mannitol Sigma Aldrich M1902-1KG
Sucrose Fisher Scientific S5-3
KH2PO4 Fisher Scientific AC424205000
KOH Sigma Aldrich P1767
Gelzan CM Sigma Aldrich G1910-250G
6-well plate Thermo Scientific 103184
96-well 1.2 ml deep well plate Thermo Scientific AB-0564
96 well optical bottom plate Thermo Scientific 165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tips Thermo Scientific 9405 163
NaCl Fisher Scientific BP358-10
KCl Sigma Aldrich P4504-1KG
MES Fisher Scientific AC17259-5000
MgCl2 Fisher Scientific M33-500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
  2. Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
  3. Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
  4. Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
  5. Marco, F., et al. . Plant Biology and Biotechnology. , 579-609 (2015).
  6. Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
  7. Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
  8. Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
  9. Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327 (2014).
  10. Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
  11. Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
  12. Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13 (2006).
  13. Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -. L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
  14. Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
  15. Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
  16. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  17. Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
  18. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
  19. Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
  20. Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
  21. Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
  22. Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
  23. Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
  24. Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
  25. de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
  26. Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510 (2013).
  27. Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
  28. Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
  29. Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
  30. Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37 (2014).
  31. Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680 (2008).
  32. Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
  33. Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
  34. Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
  35. Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831 (2014).
  36. Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
  37. Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
  38. Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
  39. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
  40. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
  41. Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
  42. Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
  43. De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).

Tags

Protoplast IsolationHigh-throughput ScreeningPlant BiotechnologyAutomated Protoplast ProductionProtoplast TransformationBY-2 Suspension CultureMicroplate MoverLiquid HandlerMulti-mode Plate ReaderMulti-mode DispenserPlate HeaterPlate ChillerRobotics SystemPlate Mover SoftwareLabwareContainer TypesStart And End Positions
check_url/54300?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dlugosz, E. M., Lenaghan, S. C., Stewart, Jr., C. N. A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation. J. Vis. Exp. (115), e54300, doi:10.3791/54300 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image