उच्च throughput मूलतत्त्व अलगाव और परिवर्तन के लिए एक रोबोट मंच
Summary
एक उच्च throughput, स्वचालित, तंबाकू मूलतत्त्व उत्पादन और परिवर्तन कार्यप्रणाली में वर्णित है। रोबोटिक प्रणाली मॉडल के आधार पर 2-प्रणाली है कि गैर मॉडल फसलों के लिए अनुवाद होना चाहिए में व्यापक समानांतर जीन अभिव्यक्ति और खोज के लिए सक्षम बनाता है।
Abstract
पिछले दशक के दौरान वहाँ संयंत्र protoplasts कि मॉडल प्रजातियों से लेकर प्रजातियों की फसल के लिए, संकेत पारगमन मार्ग, विनियामक नेटवर्क, जीन अभिव्यक्ति, जीनोम संपादन, और जीन मुंह बंद करने के विश्लेषण के लिए के उपयोग में एक पुनरुत्थान किया गया है। इसके अलावा, महत्वपूर्ण प्रगति protoplasts से पौधों के उत्थान, जो संयंत्र जीनोमिक्स के लिए इन प्रणालियों के उपयोग में भी अधिक रुचि उत्पन्न की है में किया गया है। इस काम में, एक प्रोटोकॉल एक रोबोट मंच का उपयोग कर एक 'चमकीले पीले' 2 (द्वारा -2) तंबाकू निलंबन संस्कृति से मूलतत्त्व अलगाव और परिवर्तन के स्वचालन के लिए विकसित किया गया है। परिवर्तन प्रक्रियाओं नारंगी रंग का एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ओएफपी) रिपोर्टर जीन (pporRFP) फूलगोभी मोज़ेक वायरस 35S प्रमोटर (35s) के नियंत्रण के अधीन का उपयोग कर मान्य किया गया। मूलतत्त्वों में ओएफपी अभिव्यक्ति epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की गई। विश्लेषण भी मूलतत्त्व उत्पादन क्षमता तरीकों का उपयोग कर propidiu शामिलएम आयोडाइड। अंत में, कम लागत वाली खाद्य ग्रेड एंजाइमों मूलतत्त्व अलगाव की प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया गया, प्रयोगशाला ग्रेड एंजाइमों कि लागत निषेधात्मक उच्च throughput स्वचालित मूलतत्त्व अलगाव और विश्लेषण में हैं के लिए जरूरत circumventing। इस काम में विकसित प्रोटोकॉल पर आधारित है, परिवर्तन करने के लिए मूलतत्त्व अलगाव से पूरी प्रक्रिया के तहत 4 घंटा में आयोजित किया जा सकता है, ऑपरेटर से कोई इनपुट के बिना। प्रोटोकॉल इस काम में विकसित द्वारा -2 सेल संस्कृति के साथ मान्य किया गया था, वहीं प्रक्रिया और तरीकों किसी भी संयंत्र निलंबन संस्कृति / मूलतत्त्व प्रणाली है, जो फसल जीनोमिक्स अनुसंधान के त्वरण के लिए सक्षम होना चाहिए करने के लिए अनुवाद किया जाना चाहिए।
Introduction
हाल के वर्षों में ट्रांसजेनिक फसलों के डिजाइन, विभिन्न रोगों 1 काबू पाने के वृत्तिदान शाक प्रतिरोध 2, सूखा 3,4 और नमक सहिष्णुता 5 प्रदान करने पर रखा महत्वपूर्ण प्रोत्साहन नहीं किया गया है, herbivory 6 रोकने बायोमास उपज 7 बढ़ाने के लिए, और सेल दीवार अवज्ञा में कमी 8। इस प्रवृत्ति को जीनोम संपादन CRISPR और TALENS 9 का उपयोग कर, और जीन dsRNA 10, miRNA 11, और 12 के माध्यम से siRNA मुंह बंद करने सहित ट्रांसजेनिक पौधों, पैदा करने के लिए नए आणविक उपकरणों के विकास के द्वारा सहायता प्राप्त किया गया है। इन प्रौद्योगिकियों ट्रांसजेनिक पौधों की पीढ़ी को सरल बनाया है, वे भी एक अड़चन है, जहां ट्रांसजेनिक पौधों की सरासर संख्या उत्पन्न पारंपरिक प्रणालियों है कि संयंत्र के उत्थान पर भरोसा नहीं किया जा सकता का उपयोग कर जांच की पैदा की है। इस अड़चन से संबंधित है, जबकि मुंह बंद करने और जीनोम संपादन निर्माणों तेजी से पौधों में डाला जा सकता है, के कईलक्षित लक्षण वांछित प्रभाव है, जो अक्सर की खोज नहीं है, जब तक पौधों ग्रीन हाउस में विश्लेषण कर रहे हैं का निर्माण करने के लिए असफल। इस काम में, हम विशेष रूप से जीनोम संपादन और जीन की बड़ी संख्या के लक्ष्यों को मुंह बंद करने की जल्दी स्क्रीनिंग में वर्तमान टोंटी संबोधित करने के लिए, तेजी से, स्वचालित, उच्च throughput संयंत्र protoplasts की स्क्रीनिंग के लिए एक तरीका विकसित किया है।
protoplasts के उपयोग, के रूप में बरकरार संयंत्र कोशिकाओं का विरोध किया, एक स्वचालित मंच के विकास के लिए कई फायदे हैं। सबसे पहले, protoplasts संयंत्र सेल की दीवार के पाचन के बाद अलग कर रहे हैं, और इस बाधा नहीं रह वर्तमान के साथ, परिवर्तन दक्षता 13 की वृद्धि हुई है। बरकरार संयंत्र कोशिकाओं में वहाँ परिवर्तन के लिए केवल दो अच्छी तरह से स्थापित विधियों, biolistics 14 और एग्रोबैक्टीरियम मध्यस्थता परिवर्तन 15 हैं। इन तरीकों से न तो आसानी से, तरल प्लेटफार्मों से निपटने के लिए अनुवाद किया जा सकता है, क्योंकि biolistics transfo के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता हैrmation, जबकि एग्रोबैक्टीरियम मध्यस्थता परिवर्तन सह संस्कृति और बैक्टीरिया के बाद हटाने की आवश्यकता है। न तो उच्च तरीकों के लिए उत्तरदायी हैं। Protoplasts के मामले में, परिवर्तन नियमित रूप से पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) मध्यस्थता अभिकर्मक 16 है, जो केवल कई समाधान के आदान-प्रदान की आवश्यकता है, और आदर्श तरल प्लेटफार्मों से निपटने के लिए अनुकूल है का उपयोग किया जाता है। दूसरा, protoplasts, परिभाषा से, एकल कोशिका संस्कृतियों, और इस तरह के संयंत्र सेल संस्कृतियों में clumping और चेन गठन के साथ जुड़े समस्याएं हैं, मूलतत्त्वों में नहीं मनाया जाता है। एक थाली आधारित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, कोशिकाओं की clumping का उपयोग कर तेजी से जांच के संदर्भ में, या कई विमानों में कोशिकाओं को लगातार माप प्राप्त करने में कठिनाई को बढ़ावा मिलेगा। चूंकि protoplasts भी उनकी संस्कृति मीडिया से सघन रहे हैं, वे कुओं की तह तक तलछट, एक monolayer, जो प्लेट आधारित spectrophotometry के लिए अनुकूल है बनाने। अंत में, संयंत्र सेल निलंबन संस्कृतियों primar रहे हैं, जबकिily घट्टा 17 से निकाली गई, protoplasts संयंत्र के ऊतकों के एक नंबर से काटा जा सकता है, ऊतक विशेष अभिव्यक्ति की पहचान करने की क्षमता के लिए अग्रणी। उदाहरण के लिए, क्षमता root- या एक जीन की पत्ती विशिष्ट अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के phenotype भविष्यवाणी करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हो सकता है। इन कारणों के लिए, प्रोटोकॉल इस काम में विकसित व्यापक रूप से इस्तेमाल तंबाकू (निकोटियाना Tabacum एल) 'चमकीले पीले' 2 (द्वारा -2) निलंबन संस्कृति से अलग मूलतत्त्वों का उपयोग कर मान्य किया गया।
से-2 निलंबन संस्कृति उच्च पौधों की "हेला" सेल के रूप में वर्णित किया गया है, संयंत्र कोशिकाओं की आणविक 18 विश्लेषण में अपनी सर्वव्यापी उपयोग के कारण। हाल ही में, से-2 कोशिकाओं संयंत्र के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है तनाव 19-22, intracellular प्रोटीन स्थानीयकरण 23,24, और बुनियादी कोशिका जीव विज्ञान 25-27 प्लांट बायोलॉजी में इन संस्कृतियों के व्यापक उपयोगिता का प्रदर्शन है। से-2 संस्कृतियों का एक अतिरिक्त लाभ यह हैaphidicolin साथ संस्कृतियों सिंक्रनाइज़ करने के लिए है, जो जीन अभिव्यक्ति के लिए बढ़ाया reproducibility के लिए नेतृत्व कर सकते क्षमता 28 अध्ययन करता है। इसके अलावा, तरीकों कम लागत वाली एंजाइमों 29,30 का उपयोग करके -2 protoplasts की निकासी के लिए विकसित किया गया है, के रूप में एंजाइमों पारंपरिक रूप से protoplasts पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया लागत उच्च throughput सिस्टम के लिए बैठती है। जैसे, प्रोटोकॉल नीचे वर्णित से-2 निलंबन संस्कृति का उपयोग कर पुष्टि की गई है, लेकिन यह किसी भी संयंत्र सेल निलंबन संस्कृति को संशोधनीय होना चाहिए। सबूत की अवधारणा का उपयोग कर प्रयोगों मुश्किल मूंगा Porites से एक नारंगी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (ओएफपी) रिपोर्टर जीन (pporRFP) CAMV 35S प्रमोटर के नियंत्रण के तहत 31 porites प्रदर्शन कर रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक मूलतत्त्व अलगाव, गणन, और परिवर्तन से-2 तंबाकू निलंबन सेल संस्कृति प्रयोग करने के लिए मान्य किया गया है; हालांकि, प्रोटोकॉल आसानी से किसी भी संयंत्र के निलंबन संस्कृति ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by Advanced Research Projects Agency – Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.
Materials
| Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
| Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
| Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4 dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly (ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
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