Abstract
Mangfoldigheden af små ikke-kodende RNA (Srna) er hastigt ekspanderende og deres roller i biologiske processer, herunder genregulering, er på vej frem. Mest interessant er sRNA'er også findes uden for cellerne og er stabilt til stede i alle biologiske væsker. Som sådan ekstracellulære sRNA'er repræsenterer en ny klasse af sygdomstilstande biomarkører og sandsynligvis involveret i cellesignalering og intercellulære kommunikationsnetværk. At vurdere deres potentiale som biomarkører, kan sRNA'er kvantificeres i plasma, urin og andre væsker. Ikke desto mindre, til fuldt ud at forstå konsekvenserne af ekstracellulære sRNA'er som endokrine signaler, er det vigtigt at afgøre, hvilke luftfartsselskaber transport og beskytte dem i biologiske væsker (f.eks plasma), som celler og væv bidrager til ekstracellulære Srna puljer, og celler og væv i stand at acceptere og udnytte ekstracellulær Srna. For at opnå disse mål, er det vigtigt at isolere yderst rene populationer af ekstracellulære bærerefor Srna profilering og kvantificering. Vi har tidligere vist, at lipoproteiner, især lipoproteiner med høj densitet (HDL), transportere funktionelle microRNA (miRNA) mellem celler og HDL-miRNA er ændret betydeligt i sygdom. Her har vi detaljeret en ny protokol, der udnytter tandem HDL isolation med densitet-gradient ultracentrifugering (DGUC) og hurtigt-protein-væskechromatografi (FPLC) for at opnå yderst rent HDL for downstream profilering og kvantificere alle sRNA'er, herunder miRNA, ved hjælp af både høj -throughput sekventering og real-time PCR tilgange. Denne protokol vil være en værdifuld ressource for undersøgelse af sRNA'er på HDL.
Introduction
Ekstracellulære ikke-kodende små RNA'er (sRNA'er) repræsenterer en ny klasse af sygdomstilstande biomarkører og potentielle terapeutiske mål og sandsynligvis lette celle-til-celle kommunikation 1. Den mest undersøgte type Srna er microRNA (miRNA), som er ca. 22 NTS i længden og er forarbejdede længere precursor former og primære udskrifter 2. miRNA har vist sig at post-transkriptionelt regulere genekspression gennem undertrykkelse af protein oversættelse og induktion af mRNA nedbrydning 2. Alligevel miRNA er blot en af mange typer af sRNA'er; som sRNA'er kan spaltes fra forælder tRNA'er (tRNA-afledte sRNA'er, TDR), små nukleare RNA (Srna-afledte sRNA'er, sndRNA), små nucleolar RNA (snoRNA-afledte sRNA'er, snRNA), ribosomale RNA (rRNA-afledte sRNA'er, RDR ), Y RNA'er (yDR) og diverse andre RNA'er 1. Nogle få eksempler på disse hidtil ukendte sRNA'er er blevet rapporteret til at fungere ligner miRNA; imidlertid den biologiske fuk tio n af mange af disse sRNA'er skal stadig bestemmes, selv om roller i genregulering sandsynligvis 3-6. Mest interessant, miRNA og andre sRNA'er er stabilt til stede i ekstracellulære væsker, herunder spyt, plasma, urin og galde. Ekstracellulære sRNA'er sandsynligvis beskyttet mod RNaser gennem deres tilknytning til ekstracellulære vesikler (EV), lipoproteiner og / eller ekstracellulære ribonucleoprotein komplekser.
Tidligere vi rapporteret at lipoproteiner, nemlig high-density lipoprotein (HDL), transport miRNA i plasma 7. I denne undersøgelse blev HDL isoleres ved anvendelse af en sekventiel fremgangsmåde til densitet-gradient ultracentrifugering (DGUC), hurtig-protein-væskechromatografi (gelpermeationskromatografi gelfiltrering, FPLC), og affinitetskromatografi (anti-apolipoprotein AI (ApoA-I) immunpræcipitation ) 7. Brug begge realtid PCR-baserede low-density arrays og individuelle miRNA analyser blev miRNA niveauer kvantificeret på HDL isoleret fra helbredeDin og hypercholesterolemic fag 7. Ved hjælp af denne metode, var vi i stand til at profilere miRNA og kvantificere specifikke miRNA i meget rene HDL præparater. Siden 2011 har vi fastslået, at selv om affinitetskromatografi øger HDL renhed, antistof mætning høj grad begrænser udbyttet, og kan være omkostningseffektive uoverkommelige. I øjeblikket er vores protokol anbefaler en totrins sekventiel tandem fremgangsmåde til DGUC efterfulgt af FPLC, som også producerer høj kvalitet HDL prøver til down-stream RNA-isolering og Srna kvantificering. På grund af de seneste fremskridt inden for high-throughput sekventering af sRNA'er (sRNAseq), f.eks miRNA, og den øgede bevidsthed om andre ikke-miRNA Srna klasser, sRNAseq er den nuværende state-of-the-art i miRNA og Srna profilering. Som sådan, vores protokol anbefaler kvantificere miRNA og andre sRNA'er på HDL prøver ved hjælp sRNAseq. Ikke desto mindre kan total RNA isoleret fra HDL også bruges til at kvantificere de enkelte miRNA og andre sRNA'er eller validere sRNAseq resultater ved hjælp af real-time PCR approaches. Her beskriver vi i detaljer en protokol for indsamling, rensning, kvantificering, dataanalyse, og validering af særdeles rent HDL-sRNA'er.
Det overordnede mål med dette papir er at demonstrere gennemførligheden og processen med Srna kvantificering i meget ren HDL isoleret fra humant plasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HDL Oprensning (~ 5,5 dage)
- Densitet-ultracentrifugering (DGUC, ~ 5 dage)
- Tilføj 90 pi 100x antioxidanter til 9 ml plasma isoleret fra frisk veneblod.
- Juster plasmatæthed med KBr fra 1,006 g / ml til 1,025 g / ml ved tilsætning af 0,251 g KBr til 9 ml plasma fra trin 1.1.1 (0,0278 g / ml KBr plasma). Rock plasmaet indtil alt saltet er opløst ved stuetemperatur, og overføre til ultracentrifugerør og sikre alle bobler stiger op til toppen.
- Bøj spidsen af en 18-G kanyle til 90 ° 1 cm fra spidsen, facet opad. Ved hjælp af en sprøjte, og 18-gauge kanyle, omhyggeligt placere 3 ml overlay opløsning # 1 over plasma (tabel 1).
BEMÆRK: bøjet nål sikrer alle VLDL / IDL, LDL og HDL fjernes uden at blande med overlay. - Fjern hovedparten af boblerne i toppen, hvilket efterlader 2 - 3 i mm plads fra menisken til toppen af røret og carefully placere rørene i SW-40Ti skovle.
- Afvejes hver spand (med hætterne) på balancen, og præcis balance med det modsatte spand (bucket + cap): # 1 til # 4, # 2 til # 5 og # 3 til # 6.
BEMÆRK: Disse spande skal være afbalanceret og matches på alle tidspunkter. - Placer rotor i ultracentrifuge (Liste over Materials). Centrifuger ved 274.400 xg i 24 timer ved 4 ° C med en # 4 mellemliggende bremse.
- Fjern forsigtigt skovle fra rotoren og rørene fra spande.
- Fjern forsigtigt 2 ml fra det øverste lag af overlægget anvendelse af en sprøjte og bøjet nål. Dette vil være VLDL / IDL fraktion, der kan opbevares ved 4 ° C eller -80 ° C.
- Efter fjernelse af VLDL / IDL fraktionen, indsamle de resterende 7 ml prøve (plasma) og læg det i en 15 ml konisk rør. Bring volumen af prøven op til 9 ml med overlay løsning # 2 (tabel 1).
- Juster prøvens densitet fra 1,025 g / ml til 1.080 g / mL med KBr hjælpca 0,746 g KBr i 9 ml prøve eller 0,0828 g / ml KBr prøve. Vip forsigtigt prøve indtil al KBr er opløst (ca. 20 min) og overføre til ultracentrifugerør samtidig sikre bobler stiger til toppen.
- Med sprøjte og kanyle, omhyggeligt placere 3 ml overlay løsning # 3 over prøven (tabel 1). Efterlad 2 - 3 i mm plads fra menisken til toppen af røret.
- Fjern hovedparten af eventuelle resterende bobler i toppen af røret og anbring forsigtigt de fyldte ultracentrifugerør i SW-40Ti skovle.
- Afvejes hver spand (med hætterne) på balancen, og præcis balance med det modsatte spand + cap, som i 1.1.5.
- Placer rotor i ultracentrifuge (se liste over materialer). Centrifuger ved 274.400 xg i 24 timer ved 4 ° C med en # 4 mellemliggende bremse.
- Fjern forsigtigt skovle fra rotoren og rørene fra spande.
- Fjern forsigtigt 2 ml fra det øverste lag af overlægget anvendelse af en sprøjte og værent nål. Dette vil være LDL-fraktionen, som kan opbevares ved 4 ° C eller -80 ° C.
- Efter fjernelse af LDL-fraktionen, indsamle de resterende ca. 7 ml prøve (plasma) og læg det i en ny 15 ml konisk rør. Bring volumen af prøven (plasma) op til 9 ml med 1,080 g / ml opløsning # 4 (tabel 1).
- Juster prøvens densitet fra 1,080 g / ml til 1,30 g / ml med KBr hjælp 3,33 g KBr i 9 ml prøve (plasma) eller 0,37 g KBr for hver mL prøve. Rock eller lidt omrøre prøven, indtil alt KBr (salt) opløses og overførsel til ultracentrifugerør.
- Med sprøjte og kanyle, omhyggeligt placere 3 ml overlay løsning # 5 over prøven (tabel 1).
- Fjern hovedparten af eventuelle resterende bobler i toppen af røret, der forlader 2- 3 mm plads fra menisken til toppen af røret og anbring forsigtigt de fyldte ultracentrifugerør i SW-40Ti skovle.
- Afvejes hver spand (med hætter) på balancen, og præcis balance med det modsatte spand + cap, som i 1.1.5.
- Placer rotor i ultracentrifuge (se liste over materialer). Centrifuger ved 274.400 xg i 48 timer ved 4 ° C med en # 4 bremse.
- Fjern forsigtigt skovle fra rotoren og rørene fra spande.
- Fjern forsigtigt ca. 2 ml fra det øverste lag af overlægget anvendelse af en sprøjte og bøjet nål. Dette er HDL-fraktionen, som kan opbevares ved 4 ° C eller -80 ° C.
BEMÆRK: Efter DGUC HDL kan dialyseres til fjernelse af de høje saltopløsninger. - Dialysere, placere den opsamlede HDL-fraktionen i en forseglet dialyse muffe (10.000 MW afskæring) og dialyseres natten over i 1 l 1x PBS. Skift dialyse puffer (1x PBS) 3 gange over 24 timer. Let forstyrrelse af PBS med en magnetisk omrørerstav vil forbedre dialyse.
- Bestem proteinkoncentration DGUC-HDL ved anvendelse af en BCA fremgangsmåde 8.
- Fast-Protein Liquid Chromatografi (FPLC) eller gelpermeationskromatografi (~ 6 timer)
- Filter 1,2 mg DGUC-HDL (totalt protein) i 500 uL gennem et 0,22 um mikro-centrifugal filter (se liste over materialer), umiddelbart før injektion.
BEMÆRK: En ekstra filtrering af DGUC-HDL prøven gennem et 0,45 um mikro-centrifugal filter forud for 0,22 um filter kan være nødvendig for nogle prøver. - Saml den filtrerede DGUC-HDL prøve, indlæse FPLC (fyld) injektionssprøjte, og sikre, at der ikke er nogen bobler i sprøjten før injektion ind i FPLC.
- Indstil FPLC strømningshastigheden til 0,3 ml / minut med et tryk grænse på 2,6 MPa. Ækvilibrer kolonner med 0,2 søjlevolumener (cirka 15 ml) buffer, før injektion af prøve. Prøven sprøjtes med 3 ml buffer ind i FPLC (injektion loop) instrument og starte kørslen. Opsaml 1,5 ml fraktioner til i alt 72 fraktioner.
- Filter 1,2 mg DGUC-HDL (totalt protein) i 500 uL gennem et 0,22 um mikro-centrifugal filter (se liste over materialer), umiddelbart før injektion.
2. High-throughput Lille RNASekventering (sRNAseq, ~ 9 dage)
- RNA-isolering (~ 1 dag)
- Identificere de FPLC-fraktioner svarende til DGUC-HDL ved bestemmelse totale cholesterolniveauer under anvendelse af et kolorimetrisk kit ifølge producentens instruktioner. Brug af denne FPLC set-up, forvente at finde 6 - 7 FPLC-fraktioner indeholdende DGUC-HDL.
- Saml alle volumen (ca. 8 -1 0 ml pulje af 1,45 ml fraktion mængder) fra DGUC-HDL FPLC-fraktioner og koncentrere bruge 10 kDa mw cut-off centrifugal filteranlæg ved 4000 xg i 1 time ved 4 ° C eller indtil HDL koncentrat er ca 100 pi.
- Opsaml HDL koncentrat og kvantificere HDL total proteinkoncentration ved anvendelse af BCA-metoden 8.
- Bestem den højeste koncentration af HDL totalt protein, op til 1 mg, som kan alikvoteret fra hver prøve i sættet. For eksempel isolere RNA fra den samme mængde HDL totalt protein for hver prøve.
- Udfør RNA Isolation ved hjælpen modificeret protokol (se liste over materialer).
- Tilføj 10x volumen af phenol lysis reagens (se liste over materialer) prøve og vortex i 1 min.
- Der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Tilføj chloroform (20% af fenol lysis reagens volumen anvendt i trin 2.1.5.1) og rystes kraftigt i 15 s.
- Der inkuberes ved stuetemperatur til 2 - 3 min.
- Centrifuger i 15 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C i en afkølet centrifuge.
- Overfør den øvre vandige fase til et nyt rør, undgå interfasen.
- Tilføj 1.5x volumen af 100% ethanol til den vandige fase og vortex i 1 min.
- Opbevar prøver i mindst 1 time eller natten over ved -80 ° C.
- Fortsæt med RNA isolering protokol med de medfølgende mini kolonner.
- Eluer med 30 pi RNase-frit H 2 O. Først tilsættes 15 pi H2O direkte til fritten, centrifugering ved lav hastighed (2.000 x g) i 2 minutter, ogderefter rotere med høj hastighed (max) i 1 min. Gentag dette trin med yderligere 15 uL af H 2 O.
- fortsætte Umiddelbart til Srna biblioteket generation eller opbevares ved -80 ° C.
- Bibliotek Generation (~ 6 h)
- Forbered Srna cDNA-biblioteker ved hjælp af Srna biblioteket generation kit-protokol, som pr producentens anvisninger med én ændring af PCR-amplifikation som beskrevet nedenfor.
- Forbered PCR mastermiksens på is indeholdende 0,5 uL DNase / RNase-fri H2O, 15 uL PCR Mix (PML) og 1 pi RNA PCR Primer (RP1) per prøve (omfatter yderligere 10% for pipettering fejl).
- Tilføj 16,5 pi af PCR-blanding til hver (cDNA) prøve.
- Tildel et indeks / stregkode nummer til hver prøve for multiplexing og tilføje en pi PCR Primer Index (til det tilsvarende nummer) til prøven.
- Udfør en hurtig centrifugering under anvendelse af mikrocentrifuge.
BEMÆRK: Samlet skalnu være 30 uL per prøve. - Udfør cykelforhold for PCR-amplifikation som beskrevet i tabel 2 og 3.
- Forbered Srna cDNA-biblioteker ved hjælp af Srna biblioteket generation kit-protokol, som pr producentens anvisninger med én ændring af PCR-amplifikation som beskrevet nedenfor.
- Størrelse Vælg Srna Bibliotek fjernes adapter: Adapter (~ 1,5 time)
- Udfør bibliotek størrelse udvælgelse ved hjælp af automatisk DNA størrelse vælgeren i henhold til producentens anvisninger med følgende størrelse parametre: Mål: 156 bp, Start: 135 bp, End: 177 bp, Range Flag: Bred.
- DNA Clean Up (~ 0,5 t)
- Rydde op størrelsesselekteret Srna cDNA ifølge producentens anvisninger.
- Eluer ren og koncentreret Srna cDNA med 2 x 7 uL DNase / RNase-frit H 2 O.
- Kvantificere og vurdere Srna cDNA bibliotek Udbytte og kvalitet (~ 1 time)
- Vurdere Srna cDNA bibliotek kvalitet og størrelse ved hjælp af en høj følsomhed DNA-chip på en Bioanalyzer (Liste over Materials), som pr manufacturer anvisninger.
- Kvantificere de enkelte Srna cDNA bibliotek koncentrationer ved hjælp af en høj følsomhed DNA assay (Liste over Materials), som pr fabrikantens anvisninger.
BEMÆRK: Det anbefales at have alle prøver med forskellige indekser køre på den samme bane af strømmen celle hvis det er muligt. Hvis mere end én vognbane er påkrævet, bland case og kontrolprøver korrekt.
- High-throughput Srna sekventering (~ 7 dage)
- Pool individ indekseret Srna biblioteker baseret på ækvimolære koncentrationer.
- Screen samlet Srna biblioteker for kvalitet ved hjælp af høj-følsomhed DNA-chip på Bioanalyzer og bestemme bibliotek DNA-koncentration som i 2.5.1 - 2.5.2.
- Udfør kvantitativ PCR (qPCR) af adapter indhold for at sikre passende sekventering dybde ved hjælp af sekvensering biblioteket qPCR kvantificering kit pr producentens anvisninger (liste over materialer).
- Udfør sekventering under anvendelse af en enkelt læser, 50 Bp-protokollen til at opnå en dybde på ca. 20 - 25 m læser / prøve, i henhold til producentens anvisninger.
3. Dataanalyse (~ 1 dag)
- Brug bcl2fastq2, som pr Brugervejledning instruktioner, til preprocess rå fastq filer af demultipleksede prøver (liste over materialer).
- Brug Cutadapt at trimme adaptere 9 og fjern læser <16 nukleotider (NTS) i længden, som pr brugerguide instruktioner (Liste over Materials).
- Fjern forurening sekvenser til stede i Srna biblioteker, herunder stop løsning sekvens (STP: CCACGTTCCCGTGG) og adapter fremførsel (CTACAGTCCGACGATC) bruger removeSequenceInFastq funktion i NGSPERL rammer, som pr brugerguide instruktioner (Liste over Materials).
- Udfør kvalitetskontrol målinger ved FastQC hjælp Center for Kvantitative Sciences (CQS) værktøjer, som pr brugerguide instruktioner (Liste over Materials).
- Generer ikke-redundant liste over "identisk" læser (kollaps redundant læser) og optage kopiantal hjælp CQSTools, som pr brugerguide instruktioner (Liste over Materials).
- Juster læser til humane genom ved hjælp Bowtie1.1.2 giver en mismatch (muligheder: -a -m 100 --best --strata -v 1), som pr brugerguide instruktioner (Liste over Materials).
- Udfør læse tilpasning, optælling, og resultere sammendrag opgaver ved hjælp NGSPERL, som pr Brugervejledning instruktioner.
- Konverter eksporteret count tabel til et regneark fil.
- Normalisér læser af en bestemt klasse (f.eks miRNA) til samlede antal læser for denne klasse (f.eks, det samlede antal miRNA læser) og rapport signaler Læser Per Tilknyttede miRNA (RPMM). (F.eks RPMM = (miR-X / Total # af miRNA læser) * 1.000.000).
- Input normaliseret tæller tabel som generisk enkelt farve teknologi i software til lavt niveau og højt niveau forskellen analyser pr brugerguide instruktioner (Liste over Materials).
BEMÆRK: I øjeblikket er der ingen velkarakteriserede husholdningsgener / srnSom for HDL-Srna. Der kan anvendes et spike-i kontrol, men kan være problematisk. Normalisering til HDL total protein input eller volumen tilrådes. Vigtigst, anbefales det at validere sekventeringsresultaterne ved en af de forskellige strategier til at kvantificere miRNA og sRNA'er ved hjælp af real-time PCR eller kvantitativ PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol er en serie af etablerede metoder knyttet sammen for at muliggøre kvantificering af sRNA'er på meget ren HDL med high-throughput sekventering eller realtids-PCR (figur 1). For at demonstrere gennemførligheden og virkningen af denne protokol, blev HDL oprenset fra humant plasma ved tandem DGUC og FPLC metode. Opsamlede FPLC-fraktioner svarende til HDL (ved cholesterol fordeling) blev opkoncentreret, og totalt RNA blev isoleret fra 1 mg HDL (totalt protein). Srna biblioteker blev genereret med HDL indsamlet fra n = 4 raske forsøgspersoner. Alle menneskelige blod / plasma prøver blev indsamlet under aktiv Institutional Review Board protokol (# 070.416), og mennesker blev indskrevet med informeret samtykke, som er godkendt af Vanderbilt University School of Medicine. Tilberedt Srna biblioteker blev sekventeret ved Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics (VANTAGE) DNA-sekventering center og data analyser blev udførtbruge in-house rørledninger. Data visualiseringer blev skabt ved graftegning software.
Den kritiske behov for at udføre en anden metode (FPLC) for HDL isolation efter DGUC er på grund af mulig co-oprensning af elbiler. Elbiler er en generaliseret klasse af membran-afledte vesikler, der stammer fra multivesikulære organer (exosomer), plasmamembran spirende (mikrovesikler) og andre processer, herunder apoptotiske legemer 10. Elbiler, nemlig exosomer, er blevet rapporteret at have en lignende densitet som små HDL (figur 2A), og således kunne være til stede i HDL tæthed fraktion (1,063 - 1,21 g / ml) efter DGUC 11,12. For at fjerne elbiler og andre lipoproteiner (fx LDL), fra DGUC-HDL, blev FPLC bruges til at adskille HDL fra andre vesikler og partikler ved størrelse; HDL (7 - 12 nm i diameter) og elbiler (40 - 220 nm i diameter) kan let fraktioneres grund af deres størrelse forskelle (figur 2A, B). HDL-fraktionens var indlysende grund fordelingen af cholesterol, og DGUC-HDL FPLC-fraktioner blev puljet og opkoncentreret ved anvendelse af 10 kDa centrifugeringstrin filtre. Koncentreret HDL blev indsamlet og anvendt til nedstrøms RNA-analyse (figur 2B). For at illustrere dette punkt blev plasma pre-DGUC fraktioneret under anvendelse FPLC og fordelingen af phospholipider (phosphatidylcholin, PC); totalt kolesterol (TC), og proteinniveauer blev kvantificeret og plottet tværs fraktioner. PC, TC, og proteiner niveauer blev kvantificeret ved anvendelse af tre kolorimetriske kits. Alle tre parametre klart defineret HDL fraktioner (19 - 24) og VLDL / LDL fraktioner (14 - 18). I FPLC-fraktioneret plasma, blev protein- og lipid-signaler minimalt detekteret eller ikke detekteret overhovedet i fraktioner svarende til vesikel størrelser større end VLDL (venstre orange boks) (figur 3A). For at demonstrere DGUC adskillelse af HDL, blev DGUC-HDL også fraktioneret ved FPLC og PC, TC, og proteiner niveauer var quantifIED (figur 3B). Plotte disse værdier illustrerer co-fraktionering af en lille mængde af LDL ved hjælp DGUC og forstærker behovet for at bruge tandem DGUC-FPLC tilgang til isolering yderst rent HDL. Selvom elkøretøjer forudsiges at co-fraktionerer med HDL under DGUC, der var lidt til ingen fundet i lipid- og protein i fraktioner svarende til vesikel størrelse på over LDL (figur 3B). EV lipid og protein signatur i den forudsagte størrelsesområde er også minimalt påviseligt eller fraværende fra DGUC-VLDL og DGUC-LDL når fraktioneret ved FPLC (data ikke vist). For RNA analyse blev totalt RNA isoleret fra 1 mg tandem oprenset HDL til Srna bibliotek generation. Kort fortalt blev adaptorer ligeret til 3'og derefter 5'-terminale ender af sRNA'er, herunder miRNA og TDR (figur 4A). Ligerede produkter blev revers transkriberet (RT) og PCR amplificeret under anvendelse af PCR-primere, der huser specifikke indekser designet til multipleksing prøver under downstream sekventeringsreaktioner (figur 4A). Hver adapter er 61 NTS i længden; Derfor ville et ligeret miRNA (ca. 22 nts længde) fremstille et produkt af 144 nts i længden. Mange ikke-miRNA sRNA'er er lidt længere end miRNA (f.eks 30 - 35 NTS i længden). Som sådan vores målrettede længde produkt var 156 bps i længden. Amplificerede produkter blev størrelsesselekteret anvendelse af en automatisk DNA pirformatvælgeren og alle cDNA produkter 135 - 177 bps i længden blev opsamlet (figur 4A). De kvaliteter af størrelsesselekterede biblioteker blev vurderet ved højfølsomme DNA-chips ved hjælp af Bioanalyzer (figur 4B). Srna cDNA biblioteker af denne størrelse dukkede lidt større på grund af mulig "boblende" virkninger under analysen. For multiplex-sekventering, blev ækvimolære koncentrationer af cDNA-biblioteker samlet, renset, koncentreret og analyseres igen under anvendelse af Bioanalyzer (figur 4B). Den multipleksede prøve blev derefter sequenced anvendelse af en enkelt læser 50 bp protokol. In-house dataanalyse rørledninger blev brugt til at demultiplex prøver baseret på indekser, trim adaptere, køre kontrol målinger kvalitet, tilpasse sig til det menneskelige genom og tælle kommenteret sRNA'er. Fordelingen af normaliserede læser (Læser Per Million, RPM),> 16 NTS i længden, viser berigelsen af sRNA'er 20 - 22 nts i længden og 34 - 35 NTS i længde på HDL (figur 4C).
Justering og tælle analyse af de fire HDL-Srna biblioteker fandt, at 38% af læser tilpasning til kommenteret regioner af det humane genom var miRNA (figur 5A). Lige så rigelige (37%) var sRNA'er-afledt af tRNA'er (TDR). sRNA'er-afledt fra diverse RNA'er (f.eks Y RNA'er), rRNA'er, smRNAs, snoRNAs, og lange ikke-kodende RNA'er (lincRNAs) var også til stede på HDL (figur 5A). Efter normalisering til det samlede antal læser for hver klasse, top 50 mest rigelige miRNationale kontorer (Reads Per kortlagt miRNA, RPMM, figur 5B), TDR (Reads Per Tilknyttede TDR, RPMT, figur 5C), og andre ikke-miRNA ikke-TDR sRNA'er (Læser Per kortlagt Srna, RPMS, figur 5D) blev organiseret af heatmaps . Disse data illustrerer lighederne (f.eks HDL-miRNA) og uoverensstemmelser (f.eks TDR) af de mest udbredte HDL-sRNA'er tværs raske individer (figur 5B-D). Disse resultater viser kraften i denne strategi og protokol til at give bemærkelsesværdige indsigt i transport af sRNA'er af HDL. Ikke desto mindre bør Srna sekventering ikke påberåbes for absolut kvantificering. sRNA'er af interesse skal valideres af real-time PCR. Ligeledes kan mange forskere kun kræve kvantificering af individuelle miRNAer på HDL. Som sådan blev totalt HDL RNA isoleret fra hver genstand for relativ kvantificering af HDL-miRNA ved hjælp af real-time PCR. Fem af de mere rigelige miRNA fundet på HDL af sRNAseq blev brugt til real-time PCR-analyser for at bestemme deres niveauer på hver HDL prøve (figur 5E). De relative kvantitative værdier blev beregnet ved hjælp af en vilkårlig husholdning Ct af 32 (RQV = 2 - ΔCtArb) og normaliseret til 1000 ug HDL protein input til RNA isolation 13. Resultater fra real-time PCR undersøgelse viser, at denne protokol er også værdifuld i forbindelse med afsløring af HDL-miRNA og kvantificere forskelle på tværs af individer. Kollektivt, de præsenterede skemaer definerer de kritiske oplysninger om metoder, og resultaterne fra både high-throughput sekventering og real-time PCR tilgange repræsenterer resultater af denne protokol.
Figur 1. Repræsentant Flow-diagram af protokollen. Pure HDL isoleres fra densitetsgradientultracentrifugering og hurtigt protein flydende Chromatog raphy. Totalt HDL-RNA kan derefter anvendes til små RNA (Srna) sekventering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Isolering af HDL. (A) Figur af densiteten og diameteren af lipoproteiner og ekstracellulære vesikler (EV). (B) Skematisk af sekventiel tandem HDL isolation, herunder plasma separation, densitet-gradient ultracentrifugering (DGUC), fast-protein (FPLC), filtrering og koncentration. klik her for at se en større version af dette tal.
pload / 54.488 / 54488fig3.jpg "/>
Figur 3. Hurtig-protein væskechromatografi (FPLC) Adskillelse af lipoproteiner EV, ekstracellulære vesikler.; VLDL, meget low-density lipoprotein; LDL, low-density lipoprotein; HDL, high-density lipoprotein; FP, frit protein; PC, phosphatidylcholin; og TC, total cholesterol. Røde linje, TC; Blå linie, protein og sort linie, PC. Adskillelse af lipoproteiner fra (A) humant plasma før tæthed-ultracentrifugering (DGUC) og (B) HDL fraktion efter DGUC. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. generation af små RNA biblioteker. (A) Skematisk af små RNA (Srna) bibliotek cygning og størrelse udvælgelse. miRNA, microRNA; TDR, tRNA-afledte sRNA'er; Srna, non-miRNA non-TDR sRNA'er; RT, revers transkription; bp, basepar; og cDNA, klonet DNA. (B) Analyse af HDL-Srna biblioteker før og efter multiplexing ved hjælp af høj-følsomhed DNA-chips og Bioanalyzer. (C) Længde distribution af HDL-Srna læser efter sekventering. RPM, Læser Per Million; M, mandlige forsøgspersoner; F, kvindelige individer; og nt, nucleotid. N = 4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. mangfoldighed HDL-sRNA'er. (A) Fordeling af HDL-sRNA'er tværs Srna klasser. Fraktion af læser tilpasset kommenteret sRNA'er i det humane genom. (BD) Heatmaps N = 4 HDL-Srna prøver.
| 1. Antioxidanter til lipoprotein separation | Lav stamopløsning på 100x |
| EDTA | Ethylendiamintetraeddikesyre (0,5 M stamopløsning) |
| AZT | 3-amino-1,2,4-triazol: 42 mg / ml H2O |
| BHT | Butylhydroxytoluen: 25 mg / 100 pi EtOH |
| Trolox | (+) - 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylsyre: 41,7 mg / 500 pi EtOH |
| 2. Overlay Solutions | |
| Løsning # 1 | 1,019 g / ml i H2O |
| Løsning # 2 | 1,025 g / ml KBr / H2O |
| Løsning # 3 | 1,063 g / ml KBr / H2O |
| Løsning # 4 | 1.080 g / mL KBr / H2O |
| Løsning # 5 | 1,255 g / ml KBr / H2O |
| 3. FPLC Buffer | </ Tr> |
| 1 L Opskrift | 50 ml 3 M NaCl; 20 ml 0,5 Tris-HCl, pH 7,6; 2 ml 10% natriumazid; 930 ml H2O |
Tabel 1. Særlige reagenser.
| Scene | Temp (° C) | Tid | Cykler |
| EN | 98 | 30 s | 1 |
| B | 98 | 10 s | 25 |
| 60 | 30 s | ||
| 72 | 15 s | ||
| C | 72 | 10 min | 1 |
Tabel 2.Bibliotek Generation Amplification Steps.
| Primer | sekvens |
| Primer 1.1 | AATGATACGGCGACCACCGAGAT |
| Primer 2.1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
Tabel 3. PCR-primere.
| Scene | Temp (° C) | Tid | Cykler |
| EN | 95 | 10 min | 1 |
| B | 95 | 10 s | 40 |
| 60 |
Tabel 4. Bibliotek Kvantificering Amplification Steps.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol er udviklet til at kvantificere miRNA og andre sRNA'er ved high-throughput sekventering eller realtids-PCR på meget ren HDL. Som med enhver fremgangsmåde bør særlige hensyn gives til hvert trin i processen med rensning af HDL og RNA og derefter kvantificere sRNA'er. Denne protokol er beregnet til projekter starter med ≥ 2 ml plasma. Ikke desto mindre kan høj kvalitet RNA analyser held suppleres med HDL oprenset fra så lidt som 80 pi humant eller muse plasma under anvendelse af affinitetskromatografi; dog større start plasma mængder producere bedre data ved hjælp af metoder, der præsenteres her. Prøve forarbejdning og udvindingsmetoder kan drastisk ændre miRNA / Srna kvalitet og udbytte. Brugen af antikoagulantia, mens afgørende for plasma indsamling, sandsynligvis påvirker udvinding nedstrøms. For eksempel er heparin ikke let fjernes under RNA-ekstraktion 14,15, og kan inhibere downstream enzymer udnyttes i PCR 16-18. Desuden there er rapporter om, at natriumcitrat også kan forstyrre qPCR målinger hvor miRNA fra EDTA prøver vist at have forbedret udtryk profil i forhold til natriumcitrat prøver 16,19,20. Disse undersøgelser viser behovet for nøje overvejelse, når de vælger en antikoagulant. På grund af øget potentiale for cellelyse under koagulering, serumprøver ikke anbefales som lyserede cellulære miRNA kan kunstigt forbinder med lipoproteiner. Ligeledes er plasma ideelt isoleret straks fra fuldblod for at undgå forurening fra andre perifere blodceller, herunder lyserede leukocytter. Som kold temperatur er almindeligt kendt for at påvirke blodpladeaktivering, er fuldblodsprøver spundet væk fra erythrocytter, leukocytter og blodplader ved 3.000 xg i 15 minutter ved stuetemperatur. Hæmolyse også ubetænksomt som sprængte erythrocytter er blevet rapporteret at også påvirke miRNA resultatet 21,22, da de indeholder miRNA, som kan kaste under hemolysis 23,24. Plasma kan derefter opbevares ved 4 ° C i 2 - 4 uger, eller alternativt plasma kan fryses ved -80 ° C, hvor miRNA indhold er stabil og levedygtig i både kort og lang tids opbevaring (max 4 år) 25. Vores nuværende viden, frysning plasmaprøverne ikke forudsiges at skade HDL-miRNA og frosne plasmaprøver er egnede til at analysere. Som lipoproteiner og andre hele blodkomponenter kan påvirkes af fødeindtagelse, er fastende blodprøvetagning foretrækkes.
Som nævnt ovenfor kan plasma HDL isoleres gennem en række standardmetoder, herunder DGUC, FPLC og affinitetskromatografi mod ApoA-I. . Isolering af plasma lipoproteiner ved DGUC hjælp KBr, som beskrevet af Redgraves et al 26, adskiller VLDL (d = 0,94 - 1,006 g / ml), LDL (d = 1,006-1,063 g / ml) og HDL (d = 1,063-1,21 g / ml) og er en ideel metode til store mængder plasma (2 - 60 ml per prøve). begrænsningentil anvendelse af alene denne tilgang er, at exosomer og andre miRNA indeholdende elbiler er rapporteret at have en lignende densitet til HDL og kan være til stede i DGUC HDL (figur 2A). Andre ulemper omfatter mulig strukturel skade på proteiner af høj salt eksponering i buffere og stærke ultracentrifugering kræfter samt differentierede stabiliteter af HDL underklasser 27,28. På trods af dette, er DGUC almindeligt anvendt som det resulterer i et højt udbytte af HDL-protein, der producerer tæt på 1 mg HDL protein pr 1 ml plasma 29. FPLC fremgangsmåde, der består størrelse-eksklusion gelfiltrering, kræver mindre tid, afhængigt af strømningshastigheden (ca. 6 timer), og har større præcision adskille HDL fra apoB-holdige lipoproteiner (efter størrelse) og deres underklasser, herunder elbiler der er meget større end HDL, men har ens vægtfylder. Det skal bemærkes, at anvendelse af de beskrevet i denne protokol metoder, plasma vesikler mellem ca. 220 - 75 nm i diameter ikkefremkalde et påviseligt lipid eller protein signatur skal adskilt ved hjælp af FPLC. Afhængigt af den opsætning, FPLC kræver relativt lille input, 0,3 - 1 ml, som er nyttig til gnaver plasma og små frosne portioner. Hurtige kolorimetriske kolesterol assays er også vigtigt efter FPLC at bekræfte fordelingen af HDL eller andre lipoproteinfraktioner. Fraktionering fortynder prøver og lipoproteiner; dog kan prøverne derefter koncentreres ved anvendelse af standard centrifugal size-filtre (f.eks 10 kDa MW afskæringsmembran filter). HDL isolation af apo-I IP hjælp mikro-spin-kolonner er den hurtigste af de tre metoder, men er begrænset af lavt input (0,08-1 pi) volumen og lavt udbytte (ca. 0,1 mg). Mens apo-I IP kan være besværlig, denne metode er ideel til lav volumen cellekultursupernatanter. Mens hver af disse metoder har styrker og svagheder, kan disse reduceres, hvis de anvendes i tandem (f.eks DGUC fulgte FPLC). Brug to tilgange i tandem, resultater i større renhed afHDL for miRNA og Srna analyse.
Her detaljeret vi de nødvendige skridt til at isolere meget ren HDL ved hjælp af tandem metode DGUC efterfulgt af FPLC og skitserede de trin, der anvendes til at kvantificere HDL-miRNA og sRNA'er ved hjælp af enten high-throughput sekventering eller real-time PCR. Selv om denne protokol blev udviklet til HDL, det har stor anvendelighed i kvantificere sRNA'er på andre lipoproteiner, herunder LDL og VLDL, baseret på deres densiteter og størrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45 µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
