Abstract
küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar çeşitliliği (Srna) hızla genişlemektedir ve gen regülasyonu dahil olmak üzere biyolojik süreçlerde, rolleri, ortaya çıkmaktadır. İlginç olan, sRNAs ayrıca hücrelerin dışında bulunan ve sabit bir şekilde tüm biyolojik sıvılar içinde mevcut bulunmaktadır. Bu nedenle, hücre dışı sRNAs hastalığı biyomarkerler yeni bir sınıfını temsil eder ve büyük olasılıkla hücre sinyal iletimi ve hücreler arası iletişim ağları dahil olmaktadır. biyolojik olarak potansiyellerini değerlendirmek için, sRNAs plazma, idrar ve diğer sıvıları belirlenebilir. Bununla birlikte, tam endokrin sinyaller olarak hücre dışı sRNAs etkisini anlamak için, taşıyıcıları taşınması ve hücre ve dokular dışı Srna havuzları katkıda biyolojik sıvılarda (örneğin, plazma), onları korumak ve hücreler ve yetenekli dokular olduğunu belirlemek önemlidir kabul ediyor ve hücre dışı Srna kullanan. Bu hedeflere ulaşmak için, hücre-dışı taşıyıcıların yüksek derecede saf popülasyonlarının izole edilmesi için önemlidirSrna profil ve ölçümü için. Daha önce lipoproteinler, özellikle yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL), hücre ve HDL-miRNA'ların arasında işlevsel microRNA (MiRNA) önemli ölçüde hastalık değişmiş taşıma olduğunu göstermiştir. Burada, detay yoğunluk-gradyan Ultrasantrifügasyon (DGUC) ve hızlı protein-sıvı kromatografisi (FPLC) ile tandem HDL izolasyonunu kullanan yeni bir protokol yüksek ikisini de kullanarak, aşağı profilleme ve miRNA'ların dahil olmak üzere tüm sRNAs, ölçümü için son derece saf HDL elde etmek için -throughput sekanslama ve gerçek zamanlı PCR yaklaşımlar. Bu protokol HDL üzerinde sRNAs araştırılması için değerli bir kaynak olacaktır.
Introduction
Ekstrasellüler kodlamayan küçük RNA'lar (sRNAs) hastalığı biyomarkerlerin ve potansiyel terapötik hedeflerin yeni bir sınıfını temsil ve muhtemel hücre-hücre iletişimi 1 kolaylaştırır. Srna en çok çalışılan tip uzunluğu yaklaşık 22 NTS ve daha uzun habercisi formları ve primer transkript 2 işlenir mikroRNAlar (miRNA) 'dir. miRNA'lar transkripsiyonel-sonrası protein çevirisinin ve mRNA degradasyon 2 indüksiyonu bastırılması vasıtasıyla gen ekspresyonunu düzenlemek için gösterilmiştir. Bununla birlikte, miRNA'ların sRNAs birçok türleri sadece biri; sRNAs üst tRNA'ların (tRNA türetilmiş sRNAs TDR), küçük nükleer RNA (Srna türetilmiş sRNAs, sndRNA), küçük çekirdekçik RNA'lar (snoRNA türetilmiş sRNAs, snRNA), ribozomal RNA klivaj edilebilir (sRNAs RDR rRNA türetilmiş ) Y RNA'lar (yDR) ve diğer çeşitli RNA'lar 1. Bu yeni sRNAs birkaç örnek miRNA'ların benzer işlev bildirilmiştir; Ancak, biyolojik fugen düzenlemesi roller 3-6 olasılığı olmasına rağmen, bu sRNAs birçok nctions tespit edilmesi gerekmektedir. İlginç olan, miRNA'ların ve diğer sRNAs tükürük, plazma, idrar, safra içeren hücre dışı akışkanlar içinde stabil bir şekilde yer almaktadır. Ekstrasellüler sRNAs olasılıkla ekstrasellüler veziküllerin (EV), lipoproteinler ve / veya hücre dışı Ribonükleoprotein kompleksleri ile dernek aracılığıyla RNases korunur.
Daha önce, bu lipoproteinlerin, yani, yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL) plazma 7 taşıma miRNA'lar bildirilmiştir. Bu çalışmada, HDL ardışık yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme yöntemi (DGUC), hızlı protein sıvı kromatografi (boyut dışlama kromatografisi, jel filtrasyon, FPLC) ve afinite kromatografisi (anti-apolipoprotein Al (apoA-l) imüno kullanılarak izole edildi ) 7. Gerçek zamanlı PCR bazlı, düşük yoğunluklu diziler ve bireysel MiRNA analizlerine kullanarak MiRNA düzeylerde HDL üzerindeki sayısal iyileşmesi izole edildisenin ve hiperkolesterolemik konular 7. Bu yaklaşımı kullanarak, biz miRNA'lar profil ve oldukça saf HDL hazırlıkları belirli miRNA'lar ölçmek için başardık. 2011 yılından bu yana afinite kromatografisi HDL saflığı artırır, ancak antikor doygunluk büyük ölçüde verim sınırlar ve maliyet açısından çok pahalı olabilir belirledik. Şu anda, bizim protokol aynı zamanda aşağı akım RNA izolasyonu ve Srna ölçümü için yüksek kaliteli, HDL örnekleri üreten FPLC, ardından DGUC bir iki adımlı sıralı tandem yöntemi önerir. Nedeniyle yüksek verimli örneğin sRNAs (sRNAseq), miRNA'lar sıralanması, ve diğer non-miRNA Srna sınıfların artan farkındalık son gelişmeler için, sRNAseq cari state-of-the-art miRNA ve Srna profilleme. Bu nedenle, bizim protokol miktarının miRNA'lar ve sRNAseq kullanarak HDL örneklerinde diğer sRNAs önerir. Bununla birlikte, HDL izole edilmiş toplam RNA da tek tek miRNA'lar ve sRNAs ölçmek veya gerçek zamanlı PCR kullanılarak sRNAseq Sonuçları doğrulamak için kullanılabiliryaklaşırsa. Burada toplama, arıtma, ölçümü, veri analizi ve oldukça saf HDL-sRNAs doğrulanması için detaylı bir protokol açıklar.
Bu yazıda genel amacı, insan plazmasından izole son derece saf HDL Srna ölçümü fizibilite ve süreci göstermektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HDL saflaştırma (~ 5.5 gün)
- Yoğunluk-Gradient Ultrasantrifügasyon (DGUC, ~ 5 gün)
- Taze toplardamar kanından izole plazma 9 ml 100x, anti-oksidanlar, 90 uL ekleyin.
- Aşama 1.1.1 (0,0278 g / ml KBr plazma) plazma 9 mL 0.251 gr KBr eklenerek 1.025 g / mL, 1.006 g / ml arasında KBr plazma yoğunluğunu ayarlar. tüm tuz, oda sıcaklığında çözülür ve tüpler ultrasantrifüjdeki ve tüm kabarcıklar üste çıkar sağlamak transfer edilene kadar plazma sallayın.
- Bend ucundan 90 ° 1 cm 18 G iğne ucu, konik tarafı yukarı bakacak. Bir şırınga ve 18-gauge iğne kullanılarak, dikkatli bir plazma (Tablo 1) üzerinde bindirme çözüm # 1 3 mL yerleştirin.
NOT: bükük iğne tüm VLDL / IDL, LDL sağlar ve HDL kalıbı ile karışmadan kaldırılır. - tüp ve dikkatli bir şekild üstüne menisküs 3 mm boşluk - 2 bırakarak üstünde kabarcıklar çoğunluğu, kaldırLly SW-40Ti kova tüpleri yerleştirin.
- dengesine (kapakları) her kova tartılır ve tam tersi kova (kova + kapak) ile denge: # 5 ve # 3 # 6 # 4, # 2 # 1.
NOT: Bu kovalar dengeli ve her zaman uyumlu olması gerekir. - (Malzeme Listesi) ultrasantrifüjdeki rotor yerleştirin. bir # 4, ara fren 4 ° C'de 24 saat boyunca 274.400 x g'de santrifüjleyin.
- Dikkatle kovalar rotor kova ve tüpler kaldırın.
- Dikkatli bir şırınga ve bükülmüş iğne kullanarak bindirmenin üst tabakadan 2 mL çıkarın. Bu 4 ° C'de saklanabilir VLDL / IDL kısmını oluşturmaktadır ° C veya -80 ° C.
- VLDL / IDL fraksiyonu çıkardıktan sonra, numune (plazma) kalan 7 mL toplamak ve bir 15 ml konik tüp içine yerleştirin. Bindirme çözüm # 2 (Tablo 1) ile 9 mL numune hacmi getirin.
- 1.080 g 1.025 g / ml örnek yoğunluğunu ayarlayın / KBr ile ml kullanarak9 ml numune ya da 0,0828 g yaklaşık 0.746 gr KBr / numunenin ml KBr. Tüm KBr (yaklaşık 20 dakika) içinde çözülür ve sağlanması kabarcıklar üstüne yükselir ise tüp ultrasantrifüjdeki aktarmak kadar yavaşça örnek sallayın.
- Şırınga ve iğne ile, dikkatli bir şekilde örnek (Tablo 1) bindirme çözeltisi 3. 3 mL yerleştirin. tüpün üstüne menisküs 3 mm boşluk - 2 bırakın.
- tüpün üst kısmında kalan kabarcıkların çoğunluğu kaldırmak ve dikkatle SW-40Ti kova dolu ultrasantrifüjdeki tüpleri yerleştirin.
- dengesine (kapakları) her kova tartılır ve tam 1.1.5 gibi, karşıt kova + kapaklı denge.
- ultrasantrifüjdeki Rotoru yerleştirin (Malzeme listesi bakınız). bir # 4, ara fren 4 ° C'de 24 saat boyunca 274.400 x g'de santrifüjleyin.
- Dikkatle kovalar rotor kova ve tüpler kaldırın.
- Dikkatle bir şırınga kullanarak bindirmenin üst tabakadan 2 mL çıkarın ve olmaknt iğne. Bu 4 ° C'de saklanabilir LDL fraksiyonu olacaktır ° C veya -80 ° C.
- LDL fraksiyonu çıkardıktan sonra, numune (plazma) kalan yaklaşık 7 ml toplamak ve yeni bir 15 ml konik tüp içine yerleştirin. 1.080 g / ml solüsyon # 4 (Tablo 1) 9 mL kadar örneği (plazma) hacminin getirin.
- 1.30 g 1,080 g / ml örnek yoğunluğunu ayarlayın / KBr örneğin her mL için KBr 9 mL örnek (plazma) içinde 3.33 g KBr kullanarak ya da 0.37 g ml. Kaya veya hafifçe tüm KBr (tuz) eriyene kadar numuneyi ajitasyon ve tüp ultrasantrifüjdeki aktarın.
- Şırınga ve iğne ile, dikkatli bir şekilde örnek (Tablo 1) bindirme çözeltisi 5. 3 mL yerleştirin.
- tüpün üstüne menisküs 2- 3 mm boşluk bırakarak, tüpün üstünde kalan kabarcıkların çoğunluğu kaldırmak ve dikkatle SW-40Ti kova dolu ultrasantrifüjdeki tüpleri yerleştirin.
- (Her kova tartılırdenge üzerine kapaklar), ve tam ile 1.1.5 gibi karşıt kova + kapaklı denge.
- ultrasantrifüjdeki Rotoru yerleştirin (Malzeme listesi bakınız). Bir 4. fren 4 ° C 'de 48 saat boyunca 274.400 x g'de santrifüjleyin.
- Dikkatle kovalar rotor kova ve tüpler kaldırın.
- Dikkatli bir şırınga ve bükülmüş iğne kullanılarak bindirme üst tabakasının yaklaşık 2 mL çıkarın. Bu, 4 ° C ya da -80 ° C'de muhafaza edilebilir HDL fraksiyonu vardır.
NOT: DGUC HDL ardından yüksek tuz çözüm kaldırmak için diyalize edilebilir. - kapalı bir diyaliz kovanı (10.000 mw cut-off) toplanan HDL fraksiyonu koyun ve 1 L 1x PBS gecede dialyze, diyaliz. Değişim diyaliz tamponu (1x PBS) 24 saat boyunca 3 kez. Manyetik bir karıştırma-bar ile PBS nazik pertürbasyon diyaliz artıracaktır.
- Bir BCA yöntemi 8 kullanarak DGUC-HDL protein konsantrasyonu belirleyin.
- Hızlı protein sıvı chromatography (FPLC) ya da boyut-dışlama kromatografisi (~ 6 saat)
- 0.22 mikron mikro santrifüj filtre ile 500 mcL DGUC-HDL (toplam protein) 1.2 mg Filtre enjeksiyondan hemen önce, (Malzeme listesi bakınız).
Not: 0.22 um'lik bir filtreden önce 0.45 um mikro santrifüj filtre ile DGUC HDL numunenin ilave filtreleme Bazı örnekler için gerekli olabilir. - , Süzülmüş DGUC-HDL örnek toplamak FPLC (dolgu) enjeksiyon şırınga yükleyin ve şırınga hiçbir kabarcıklar FPLC içine enjekte önce olmamasına dikkat edin.
- 2.6 MPa bir basınç sınırı 0.3 mL / dak FPLC akış hızını ayarlayın. enjeksiyon örnek önce tampon 0.2 kolon hacmi (yaklaşık 15 mL) ile sütun dengelenmesi. FPLC (enjeksiyon döngü mü?) Aracı haline tampon 3 mL numune enjekte edilir ve çalışma başlatmak. 72 fraksiyonların toplam 1.5 ml'lik kesirleri toplayın.
- 0.22 mikron mikro santrifüj filtre ile 500 mcL DGUC-HDL (toplam protein) 1.2 mg Filtre enjeksiyondan hemen önce, (Malzeme listesi bakınız).
2. Yüksek verim Küçük RNAArdışık (sRNAseq, ~ 9 gün)
- RNA İzolasyon (~ 1 gün)
- üreticinin talimatlarına uygun olarak kolorimetrik bir kit kullanılarak total kolesterol seviyelerinin belirlenmesiyle DGUC HDL tekabül FPLC fraksiyonlar tanımlar. DGUC-HDL içeren 7 FPLC kesirler - Bu FPLC set-up kullanarak, 6 bulmak için bekliyoruz.
- DGUC HDL FPLC fraksiyonlardan tüm hacmi (yaklaşık 8 -1 0 ml Havuz 1.45 mL fraksiyonunun hacim) toplayın ve kullanılarak konsantre 10 kDa mw kesim santrifüj filtre üniteleri, 1 saat boyunca 4000 x g'de, 4 ° C'de veya HDL konsantre kadar yaklaşık 100 ml.
- HDL konsantre toplayın ve BCA yöntemi 8 kullanarak HDL total protein konsantrasyonu ölçmek.
- kümesindeki her örnekten aliquoted edilebilir en fazla 1 mg HDL toplam proteinin en yüksek konsantrasyon, belirleyin. Örneğin, her bir örnek için, HDL toplam proteinin aynı miktarda RNA izole eder.
- kullanarak RNA izolasyonu gerçekleştirmekdeğiştirilmiş bir protokol (Malzeme listesi bakınız).
- 1 dakika boyunca fenol parçalama reaktifi (Malzeme listesi bakınız) örnek ve vorteks 10x hacim ekleyin.
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- kloroform (adım 2.1.5.1 kullanılan fenol liziz reaktifi hacminin% 20) ilave edilir ve 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır.
- 3 dakika - 2, oda sıcaklığında inkübe edilir.
- soğutulmuş bir santrifüj içinde 4 ° C'de 12,000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj.
- interfaz kaçınarak yeni bir tüpe, üst sulu faz transfer.
- 1 dakika için sulu faz ve vorteks% 100 etanol 1.5x hacim.
- en az 1 saat ya da gece boyunca -80 ° C'de saklayın örnekleri.
- sağlanan küçük sütunlar kullanılarak RNA izolasyon protokolü ile devam edin.
- 30 mL RNaz içermeyen H2O ile elüte İlk 2 dakika süreyle düşük hızda (2000 xg) frit, spin doğrudan 15 uL H 2 O ekleyin veDaha sonra 1 dakika boyunca yüksek hızda (max) dönerler. H 2 O ek 15 ul ile bu adımı tekrarlayın
- Hemen -80 ° C'de Srna kütüphane nesil ya da mağazaya geçin.
- Kütüphane Oluşturma (~ 6 saat)
- Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi PCR amplifikasyonu için bir değişiklik ile, üretici talimatlarına uygun olarak, Srna Kütüphane oluşturma kiti protokolü kullanılarak Srna cDNA kütüphaneleri hazırlayın.
- 0.5 mL DNaz / RNaz ücretsiz H 2 O içeren buz üzerinde PCR MasterMix hazırlayın, 15 uL PCR Mix (PML) ve 1 uL RNA PCR Primer (RP1) numune başına (hata pipetle için ek bir% 10 dahil).
- PCR 16.5 uL her (cDNA) örnek karıştırın ekleyin.
- çoğullama için her bir örnek için bir dizin / barkod numarası atamak ve örnek (ilgili numaraya) 1 uL PCR Primer Endeksi ekleyin.
- mikrofuge'de kullanarak hızlı bir spin gerçekleştirin.
NOT: Toplam hacim gerekirŞimdi örnek başına 30 uL olacak. - Tablo 2 ve 3'te açıklandığı gibi PCR amplifikasyonu için döngü şartları yerine.
- Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi PCR amplifikasyonu için bir değişiklik ile, üretici talimatlarına uygun olarak, Srna Kütüphane oluşturma kiti protokolü kullanılarak Srna cDNA kütüphaneleri hazırlayın.
- Boyut Srna Kütüphane Adaptörü çıkarmak için seçin: Adaptörler (~ 1.5 saat)
- Hedef: aşağıdaki boyut parametreleri ile üreticinin talimatlarına göre otomatik DNA boyutu seçici kullanarak kütüphane boyut seçimi gerçekleştirmek 156 bp Başlangıç: 135 bp, End: 177 bp, Menzil Flag: Geniş.
- DNA Clean Up (~ 0.5 saat)
- temizlemek boyut seçimine, üreticinin talimatlarına uygun olarak Srna cDNA.
- Temiz Zehir ve 2 x 7 uL DNaz / RNaz ücretsiz H2O ile Srna cDNA konsantre
- Ölçmek ve değerlendirmek Srna cDNA Library Verim ve Kalite (~ 1 saat)
- İmalat başına (Malzeme Listesi) bir Bioanalyzer üzerinde yüksek hassasiyetli DNA çip kullanan Srna cDNA kütüphanesi kalitesini ve boyutunu değerlendirmekÜrer talimatları.
- üreticinin talimatlarına göre, yüksek hassasiyetli DNA tahlili (Malzeme Listesi) kullanarak bireysel Srna cDNA kütüphanesi konsantrasyonlarını ölçmek.
NOT: Bu akış hücresi mümkünse aynı kulvarda çalıştırılacak farklı endeksleri tüm örnekleri olması tavsiye edilir. Birden fazla şeritli gerekli ise, uygun bir durumda, kontrol numuneleri karıştırın.
- Yüksek verimli Srna Dizi (~ 7 gün)
- Havuz bireysel denk molar konsantrasyonlarda dayalı Srna kütüphaneleri endeksli.
- 2.5.2 - Ekran Bioanalyzer yüksek hassasiyetli DNA çip kullanan ve 2.5.1 gibi kütüphane DNA konsantrasyonunu belirlemek kalite Srna kütüphaneleri toplanmış.
- üreticinin talimatlarına (Malzeme listesi) göre dizi kütüphanesi qPCR Niceleme Kiti kullanılarak uygun sıralama derinliğini sağlamak için bağdaştırıcı içeriği kantitatif PCR (qPCR) uygulayın.
- Tek bir okuma kullanarak sıralamayı gerçekleştirmek, 50 b25 M üreticinin talimatlarına göre, / örnek okur - p protokolü yaklaşık 20 derinliğe ulaşmak için.
3. Veri Analizi (~ 1 gün)
- çoklaması örneklerin önişlem ham fastq dosyaları (Malzeme listesi) kullanım kılavuzu talimatlarına göre, bcl2fastq2 kullanın.
- Adaptörleri 9 Döşeme ve kaldırmak için Cutadapt kullanın <okur kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) göre uzunluğu 16 nükleotid (NTS).
- Kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) uyarınca, NGSPERL çerçevesinde removeSequenceInFastq işlevini kullanarak ve adaptör carry-over (CTACAGTCCGACGATC): stop çözüm dizisi de dahil olmak üzere Srna kütüphaneler, mevcut kirlilik dizileri (CCACGTTCCCGTGG STP) sökün.
- Kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) uyarınca, FastQC Sayısal Bilimler Merkezi (CQS) araçlarını kullanarak kalite kontrol ölçümleri gerçekleştirin.
- "Özdeş" olmayan gereksiz liste oluşturmak (çökme redunda okurnt okur) ve kayıt kopya sayıları kullanım kılavuzunun talimatları Malzeme (Liste) uyarınca, CQSTools kullanarak.
- Kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) uyarınca, (-a -m 100 --best --strata -v 1 seçenekleri) hizalayın Bowtie1.1.2 1 uyumsuzluğu izin kullanarak insan genomuna okur.
- hizalama, sayma okuma gerçekleştirmek ve kullanım kılavuzu talimatına göre, NGSPERL kullanarak özetleme görevleri sonuçlanır.
- Bir tablo dosyasına ihraç sayım tabloya dönüştür.
- Başına Haritalı miRNA (RPMM) okur olarak o sınıfın (örn miRNA'lar sayısı okur) ve rapor sinyalleri için okur Normale toplam sayısı belirli bir sınıfın (örn miRNA'ların) okur. (Örneğin, RPMM = (miR-X / miRNA toplam # * 1000000) okur).
- düşük seviye ve üst düzey diferansiyeli için yazılımı içine jenerik tek renk teknolojisi olarak girdi normalize sayım tablosu kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) göre analiz eder.
NOT: Şu anda, hiçbir iyi karakterize temizlik genler vardır / SRNHDL-Srna gelince. Bir başak-kontrol kullanılabilir, ancak sorunlu olabilir. toplam protein giriş veya hacim HDL normalize tavsiye edilir. En önemlisi, gerçek zamanlı PCR veya kantitatif PCR kullanılarak miRNA'lar ve sRNAs ölçmek için çeşitli stratejiler biri tarafından sıralama sonuçlarını doğrulamak için tavsiye edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, yüksek verimli sekanslama veya gerçek zamanlı PCR (Şekil 1), son derece saf HDL sRNAs ölçümü sağlamak için birbirine bağlanmış edilmiş yöntemlerden dizisidir. fizibilite ve bu protokol etkisini göstermek için, HDL ikili DGUC ve FPLC yöntemi ile insan plazmasından saflaştırılmıştır. HDL (kolesterol dağılımı) karşılık gelen toplanan FPLC fraksiyonlar konsantre edildi ve toplam RNA HDL (toplam protein), 1 mg izole edilmiştir. Srna kütüphaneleri n = 4 sağlıklı insan deneklerden toplanan HDL ile üretilmiştir. Bütün insan kanı / plazma numuneleri aktif Kurumsal İnceleme Kurulu protokolü (# 070416) altında toplanmış ve Tıp Vanderbilt Üniversitesi tarafından onaylanan insan denekler bilgilendirilmiş onam alındı. Hazırlanan Srna kütüphaneleri Gelişmiş Genomics (VANTAGE) DNA dizi merkezi ve veri analizleri yapılmıştır Vanderbilt Technologies dizildiin-house boru hatlarını kullanarak. Veri görselleştirme yazılımları grafik oluşturulmuştur.
DGUC sonra, HDL izolasyonu için bir ikinci yöntem (FPLC) gerçekleştirmek için ciddi bir ihtiyaç EVs muhtemel ortak saflaştırma kaynaklanmaktadır. AGH apoptotik cisimlerin 10 olmak üzere multiveziküler cisim (Eksozomlann) kaynaklanan zar türetilmiş kesecikler, plazma zarı (microvesicles) tomurcuklanma ve diğer işlemler, genel bir sınıf vardır. EVs, yani eksozomlar küçük HDL (Şekil 2A) ile benzer bir yoğunluğa sahip olduğu rapor edilmiştir ve bu nedenle, HDL yoğunluğu fraksiyonunda mevcut olabilir - DGUC 11,12 sonra (1.063 1.21 gr / ml). EVS ve diğer lipoproteinlerin (örneğin, LDL) çıkarmak için, DGUC-HDL'den, FPLC boyutu diğer vesiküller ve parçacıklar ayrı HDL için kullanılmıştır; HDL (7-12 çapı nm) EVs (40 - çapı 220 nm) nedeniyle kolaylıkla boyutları farklılıkları (Şekil 2A, B) fraksiyone edilmiştir. HDL fraksiyonus dolayı kolesterol dağıtımı için aşikar idi ve DGUC-HDL FPLC fraksiyonlar bir araya toplanmış ve 10 kDa kesme santrifüj filtre ile konsantre edilmiştir. Konsantre HDL toplanmış ve aşağı RNA analizi (Şekil 2B) kullanılmıştır. Bu noktayı göstermek için, plazma önceden DGUC FPLC ve fosfolipidlerden dağılımını (fosfatidilkolin, PC) kullanılarak parçalandı; total kolesterol (TK), ve protein düzeyleri ölçülebilir ve fraksiyonları arasında çizilmiştir. Bilgisayar, TC ve proteinler seviyeleri, üç kolorimetrik kitler kullanılarak ölçüldü. ve VLDL / LDL fraksiyonları (14 - 18) - Tüm üç parametre açıkça HDL fraksiyonları (24 19) tanımlanmıştır. FPLC-kısımlara plazmada, protein ve yağ sinyalleri minimal tespit edilmiştir ya da (turuncu kutunun sol) VLDL (Şekil 3A) daha büyük boyutları vezikül karşılık gelen fraksiyonlarda bulunan tüm tespit edildi. HDL DGUC ayrılması göstermek için, DGUC-HDL ayrıca FPLC ve PC, TC ile parçalanmıştır ve proteinler düzeyleri quantif idiIED (Şekil 3B). Bu değerlerin konulması DGUC kullanılarak LDL küçük bir miktarının eş fraksiyonasyon göstermektedir ve oldukça saf HDL izole etmek için tandem DGUC-FPLC yaklaşımlara ihtiyaç güçlendirmektedir. EVs DGUC sırasında HDL ile birlikte fraksiyonlanması tahmin edilmektedir, ancak LDL (Şekil 3B) daha büyük boyutları mesaneye karşılık gelen fraksiyonlarda lipid ve protein bulundu hiçbiri az oldu. FPLC ile kısımlara zaman tahmin boyut aralığında EV lipid ve protein imzası minimal tespit edilebilir veya DGUC-VLDL ve DGUC-LDL yoktur (gösterilmeyen veri). RNA analizi için, toplam RNA, Srna kitaplığı üretimi için ikili saflaştınldı HDL 1 mg izole edilmiştir. Kısaca, adaptörler 3 've 5' miRNA'ların ve TDRs (Şekil 4A) de dahil olmak üzere sRNAs terminal uçlarına lige edilmiştir. Bağlanan ürünler ters (RT) transkribe edilmiştir ve PCR Dow sırasında çoklayıcı örnekleri için tasarlanmış özel dizinleri barındıran PCR primerleri kullanılarak amplifıyenStream sekanslama reaksiyonları (Şekil 4A). Her bağdaştırıcı uzunluğu 61 nts olduğu; Bu nedenle, bağlanan MiRNA (uzunluğu yaklaşık 22 nts) uzunluğu 144 nts bir ürün üretir. Birçok olmayan miRNA sRNAs biraz daha uzun miRNA'lar daha (örn, 30 - uzunluğunda 35 NTS). Bu nedenle, ürünün eden hedef uzunluğu uzunluğu 156 baz puan. Uzunluğu 177 bps toplanmıştır (Şekil 4A) - Amplifiye ürünler ebat bakımından seçilmiş bir otomatik DNA boyutu seçici ve 135 Tüm cDNA ürünleri kullanarak edildi. Boyutu seçilmiş kütüphanelerinin yetenekler Bioanalyzer (Şekil 4B) ile yüksek hassasiyetli DNA çipleri ile değerlendirildi. Bu boyutta Srna cDNA kütüphaneleri analizi sırasında etkileri "köpüren" mümkün nedeniyle boyut olarak biraz daha büyük çıktı. Çoğaltılmış çok katlı bir sıralama için, cDNA kütüphanelerinin denk molar konsantrasyonlarda bir araya getirilmiş, temizlenmiş, konsantre edilmiş ve Bioanalyzer (Şekil 4B) ile tekrar analiz edildi. birden fazla mesaj örnek daha sonra sequen edildiTek bir okuma 50 bp protokolü kullanılarak ced. In-house veri analizi boru hatları endekslerine dayalı örnekleri Demultiplex için kullanılan, adaptörler Döşeme, koşmak kalite kontrol ölçütleri, insan genomuna uyum ve açıklamalı sRNAs saymak. Uzunluğunda 22 NTS ve 34 - - HDL (Şekil 4C) üzerinde uzunluğu 35 NTS normalize dağılımı sRNAs 20 zenginleştirme göstermek, okur uzunluğu,> 16 nts (Başına Milyon RPM okur).
Hizalama ve dört HDL-Srna kütüphanelerin sayım analizi% 38 insan genomunun olan miRNA'lar (Şekil 5A) açıklamalı bölgelerine hizalama okur bulundu. (% 37) eşit derecede bol sRNAs türetilmiş tRNA (TDRs) satın alındı. sRNAs türetilmiş çeşitli RNA (örn, Y, RNA), rRNA, smRNAs, snoRNAs, ve uzun kodlayıcı olmayan RNA'lar (lincRNAs) HDL (Şekil 5A) da mevcuttu. sayısının toplam normalleşme sonra, her sınıf için en iyi 50 en bol mir okurUA'lar, TDRs (Per miRNA, RPMM, Şekil 5B Haritalı Okur) (Başına TDRs, RPMT, Şekil 5C Haritalı Okur), ve diğer non-miRNA olmayan tDR sRNAs heatmaps tarafından organize edildi (Per Srna, RPM'leri, Şekil 5D Haritalı okur) . Bu veriler sağlıklı kişilerde (Şekil 5B-D) genelinde en bol HDL-sRNAs (ör: HDL-miRNA'lar) ve farklılıklar (örneğin, TDRs) benzerlik göstermektedir. Bu sonuçlar HDL tarafından sRNAs taşınması içine olağanüstü bir anlayış sağlamak için bu strateji ve protokolün gücünü göstermek. Bununla birlikte, Srna sıralama mutlak kantitatif için dayanıyordu olmamalıdır. ilgi sRNAs gerçek zamanlı PCR ile valide edilmelidir. Aynı şekilde, birçok araştırmacı sadece HDL bireysel miRNA'ların ölçümü gerekebilir. Bu şekilde, toplam, HDL RNA, gerçek zamanlı PCR ile HDL-miRNA'ların rölatif ölçümü her denekten izole edildi. sRNAseq tarafından HDL tespit daha bol miRNA'lar beş rea kullanıldıl-time PCR her HDL örnek (Şekil 5E) kendi seviyelerini belirlemek için. RNA izolasyonu 13 içine HDL proteini girişinin 1.000 ug - (ΔCtArb RQV = 2) ve normalize sayısal değerler, rasgele temizlik 32 Ct kullanılarak hesaplandı. real-time PCR çalışmanın sonuçları bu protokol aynı zamanda HDL-miRNA'lar tespit ve bireyler arasında farklılıklar miktarının değerli olduğunu göstermektedir. Topluca, sunulan şemadaki yöntemlerin kritik ayrıntıları tanımlamak ve yüksek verim sıralama ve gerçek zamanlı hem de PCR yaklaşımlarından sonuçları bu protokol teslimat temsil etmektedir.
Protokolün 1. Temsilcisi Flow-grafik Şekil. Saf HDL yoğunluk gradyan Ultrasantrifügasyon ve hızlı protein sıvı kromatografiden izole edilir tomografi. Toplam HDL RNA sonra küçük RNA (Srna) sıralama için kullanılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
HDL Şekil 2. izolasyonu. (A) lipoproteinler ve hücre dışı veziküller (EV) yoğunluğu ve çapı uymaktadır. Sıralı tandem HDL izolasyonu (B) şematik, plazma ayrımı, yoğunluk-gradyan Ultrasantrifügasyon (DGUC), hızlı protein içeren sıvı kromatografisi (FPLC), filtrasyon ve konsantrasyon. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Güncelle / 54488 / 54488fig3.jpg "/>
. Lipoproteinler EV, hücre dışı veziküllerin Şekil 3. Hızlı protein Sıvı Kromatografi (FPLC) Ayırma; VLDL, çok düşük yoğunluklu lipoproteinler; LDL, düşük yoğunluklu lipoproteinler; HDL, yüksek yoğunluklu lipoproteinler; FP, serbest protein; PC, fosfatidilkolin; ve TC, total kolesterol. Kırmızı çizgi, TC; Mavi çizgi, protein, ve Siyah çizgi, PC. Önce yoğunluk-gradyan Ultrasantrifügasyon (DGUC) ve DGUC sonra (B) HDL fraksiyonunun (A) insan plazmasından lipoproteinlerin ayrılması. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Küçük RNA Kütüphaneleri Şekil 4. Nesil. Küçük RNA (Srna) kütüphane c (A) şematikonstruction ve boyut seçimi. miRNA, microRNA; tDR, sRNAs tRNA türevi; Srna, non-miRNA olmayan tDR sRNAs; RT, ters transkripsiyon; bp baz çifti; ve cDNA, klonlanmış DNA. öncesi ve yüksek hassasiyetli DNA çipleri ve Bioanalyzer kullanarak çoğullama sonra HDL-Srna kütüphanelerinin (B) analizi. HDL-Srna (C) Uzunluk dağıtım sıralama sonra okur. RPM, Million Başına okur; M, erkek denek; F kadın denekler; NT nükleotid. N = 4. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
HDL-sRNAs Şekil 5. Çeşitlilik. Srna sınıfları arasında HDL-sRNAs (A) Dağıtım. fraksiyon insan genomunda açıklamalı sRNAs hizalanmış okur. (BH) Heatmaps N = 4, HDL-Srna örnekler.
| Lipoprotein ayrılması için 1. Antioksidanlar | 100x stok solüsyonu yapmak |
| EDTA | Etilendiamintetraasetik asit (0.5 M stok) |
| AZT | 3-amino-1,2,4-triazol: 42 mg / ml H2O |
| BHT | Butile hidroksitolüen: 25 mg / 100 uL EtOH |
| Trolox | (+) - 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksilik asit: 41.7 mg / 500 uL EtOH |
| 2. Bindirme Çözümleri | |
| Çözüm 1. | 1.019 gr / ml, H2O içinde |
| Çözüm # 2 | 1.025 gr / ml KBr / H2O |
| Çözüm 3. | 1.063 gr / ml KBr / H2O |
| Çözüm 4. | 1.080 gr / ml KBr / H2O |
| 5. Çözüm | 1,255 gr / ml KBr / H2O |
| 3. FPLC tampon | </ Tr> |
| 1 L Tarif | 50 ml 3M NaCl; 20 mL 0.5 Tris-HCI, pH 7.6; % 10 sodyum azid 2 mi; 930 ml H2O |
Tablo 1. Özel Reaktifler.
| sahne | Sıcaklık (° C) | Zaman | Bisikletler |
| bir | 98 | 30 saniye | 1 |
| B | 98 | 10 s | 25 |
| 60 | 30 saniye | ||
| 72 | 15 s | ||
| C | 72 | 10 dk | 1 |
Tablo 2.Kütüphane oluşturma amplifıkasyonda.
| astar boya | Sıra |
| primer 1.1 | AATGATACGGCGACCACCGAGAT |
| primer 2.1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
Tablo 3. PCR primeri.
| sahne | Sıcaklık (° C) | Zaman | Bisikletler |
| bir | 95 | 10 dk | 1 |
| B | 95 | 10 s | 40 |
| 60 |
Tablo 4. Kütüphane Niceleme Amplifikasyon Adımlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, yüksek derecede saf HDL, yüksek verimli sekanslama ya da gerçek-zamanlı PCR ile miRNA'lar ve sRNAs ölçmek için tasarlanmıştır. Herhangi bir yaklaşımla olduğu gibi, özel durumlar arındırıcı HDL ve RNA sürecinde her adımda verilen ve daha sonra sRNAs ölçülmesi gerekir. Bu protokol, plazma ≥ 2 mL başlayarak projeler için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, yüksek kalitede RNA analizleri başarılı afinite kromatografisi kullanılarak, insan ya da fare plazması az 80, uL saflaştırılmış HDL ile tamamlanabilir; Ancak, büyük bir başlangıç plazma hacimleri Burada sunulan yöntemleri kullanarak daha iyi veri üretir. Numune işleme ve ekstraksiyon yöntemleri büyük ölçüde miRNA / Srna kalitesini ve verimini değiştirebilir. antikoagülan kullanımı, plazma koleksiyonu için gerekli süre, muhtemelen aşağı çıkarma etkiler. Örneğin, heparin kolayca RNA ekstraksiyonu 14,15 sırasında kaldırılır ve PCR 16-18 kullanılan alt baş enzimleri inhibe edebilir. Buna ek olarak, inciere sodyum sitrat da EDTA örneklerinden miRNA'lar sodyum sitrat örneklerinin 16,19,20 kıyasla ifade profili düzeldi gösterilir qPCR ölçümlerine müdahale edebilir dair raporlar vardır. bir antikoagülan seçerken bu çalışmalar dikkatli bir değerlendirme ihtiyacını ortaya koymaktadır. Ayrıca, pıhtılaşma esnasında hücre liziz için artan potansiyeli nedeniyle serum örnekleri yapay lipoproteinler ile ilişkilendirebilir lize hücresel miRNA'lar olarak tavsiye edilmez. Benzer şekilde, plazma ideal lize lökositlerin dahil olmak üzere, diğer periferal kan hücreleri, kirlenmeyi önlemek için tam kan hemen izole edilir. Soğuk sıcaklık yaygın trombosit aktivasyonu etkilediği bilinmektedir gibi, bütün kan numuneleri, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3000 x g'de eritrosit, lökosit ve platelet uzak döndürülür. Rüptüre eritrositler de miRNA sonucunu 21,22 etkilemeye bildirilmiştir onlar hemol sırasında dökmek olabilir miRNA'lar içerdiğinden Hemoliz de kötü, tavsiye edilirSalman kararı 23,24. Plazma sonra 2 için 4 ° C'de muhafaza edilebilir - 4 hafta ya da alternatif plazma miRNA içeriği kısa vadeli ve uzun süreli saklama (maksimum 4 yıl) 25 hem de istikrarlı ve yaşayabilir -80 ° C'de donmuş olabilir. Bugünkü bilgilerimize, plazma numuneleri donma HDL-miRNA'lar ve donmuş plazma örnekleri analiz etmek için uygundur zarar tahmin edilmez. lipoproteinler ve diğer bütün kan bileşenleri gıda alımı etkilenebilir olarak, açlık kan alma tercih edilmektedir.
Yukarıda belirtildiği gibi, HDL DGUC, FPLC ve apoA-I'e karşı afinite kromatografisi de dahil olmak üzere, standart yöntemler, bir numara ile izole edilebilir. . Redgraves tarafından tarif edildiği gibi KBr kullanılarak DGUC plazma lipoproteinlerinin izolasyonu ve diğ 26, VLDL ayıran (D = 0,94-1,006 gr / ml), LDL (D = 1,006-1,063 g / mL) ve HDL (D = 1,063-1,21 Örnek başına 60 ml) - g / ml) ve plazma (2 büyük miktarlar için ideal bir yöntemdir. sınırlamaSadece bu yaklaşım kullanarak eksozomlar ve EVs içeren diğer MiRNA HDL benzer yoğunluğa sahip olduğu rapor edilmiştir ve DGUC HDL (Şekil 2A) içinde mevcut olmasıdır. Diğer dezavantajlar, olası yapısal tamponlar ve güçlü ultrasantrifügasyon kuvvetlerinin yüksek tuz maruz proteinlere zarar olarak HDL alt sınıflar 27,28 ayırıcı stabilitelerini içerir. Bu plazma 29 1 mL başına HDL protein yakın 1 mg üreten HDL proteininin yüksek bir verimle sonuçlanır olarak rağmen DGUC yaygın olarak kullanılmaktadır. , Boyut dışlama jel filtrasyonu içerir FPLC yaklaşım, akış hızı (yaklaşık 6 saat) bağlı, daha az zaman gerektirir ve AGH dahil büyük (büyüklüğüne göre) apoB-içeren lipoproteinlerin gelen HDL'yi ayıran hassas ve bunların alt sınıfları vardır HDL çok daha büyük ama benzer yoğunlukları var. çapı 75 nm yok - Yaklaşık 220 arasındaki bu protokol ayrıntılı yöntemler, plazma veziküller kullanarak belirtmek gerekir kiFPLC ile ayrılmış olduğunda, saptanabilir bir lipid ya da protein imza ortaya çıkarmaktadır. kurulumu ile ilgili olarak, nispeten küçük bir FPLC girişi gerektirir, 0.3 - kemirgen plazma ve küçük dondurulmuş alikotları için yararlıdır 1 mi. Hızlı kolorimetrik kolesterol deneyleri HDL veya diğer lipoprotein fraksiyonları dağılımını onaylamak için FPLC aşağıdaki de önemlidir. Fraksiyonu örnekleri ve lipoprotein sulandırır; Bununla birlikte, örnekler daha sonra, standart radyal boyut filtreler kullanılarak konsantre edilebilir (örneğin, 10 kDa kesim mw filtre). Mikro-dönüş sütunlarını kullanarak apoA-I IP HDL izolasyon üç yaklaşımın hızlı, ancak düşük girdi ile sınırlıdır (0,08-1 ul) hacmi ve düşük verim (yaklaşık 0.1 mg). ApoA-I IP zahmetli olabilir, bu yöntem, düşük hacimli hücre kültürü süpernatanları için idealdir. Bu yöntemlerin her biri güçlü ve zayıf yanları olsa da tandem kullanıldığında, bunlar azaltılabilir (örneğin, DGUC FPLC ardından). daha fazla saflıkta iki tandem yaklaşımları sonuçları kullanarakMiRNA ve Srna analizi için, HDL.
Burada, FPLC tarafından takip DGUC tandem yöntemini kullanarak oldukça saf HDL izole etmek için gereken adımları ayrıntılı ve yüksek verimli sıralama veya real-time PCR kullanarak HDL-miRNA'lar ve sRNAs ölçmek için kullanılan adımlar sıraladı. Bu protokol, HDL için tasarlanmış olmasına rağmen, bunların yoğunlukları ve boyutlarına göre LDL ve VLDL, dahil olmak üzere diğer lipoproteinlerin hakkında sRNAs miktarının büyük uygulanabilirliği vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45 µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
