Abstract
Die Vielfalt der kleinen nicht-kodierenden RNAs (sRNA) ist schnell wachsenden und ihre Rollen in biologischen Prozessen, einschließlich der Genregulation, entstehen. Interessanterweise sRNAs werden auch außerhalb der Zellen und sind stabil in allen biologischen Flüssigkeiten gefunden. Als solche stellen extrazelluläre sRNAs eine neue Klasse von Krankheits Biomarkern und werden in Zellsignalisierung und interzellulare Kommunikationsnetze wahrscheinlich beteiligt. Ihr Potenzial als Biomarker beurteilen kann sRNAs im Plasma, Urin und anderen Flüssigkeiten quantitativ bestimmt werden. Dennoch vollständig die Wirkung von extrazellulärem sRNAs als endokrine Signale zu verstehen, ist es wichtig , zu bestimmen , welche Ladungsträger zu transportieren und sie in biologischen Flüssigkeiten (zB Plasma) zu schützen, das Zellen und Gewebe zu extrazellulärem sRNA Pools tragen und Zellen und Gewebe fähig des Annehmens und der extrazellulären sRNA verwendet. Um das zu erreichen, diese Ziele ist es entscheidend, hochreine Populationen von extrazellulären Träger zu isolierenfür sRNA Profilierung und Quantifizierung. Wir haben zuvor gezeigt, dass Lipoproteine, insbesondere Lipoproteine hoher Dichte (HDL), transportiert funktionelle mikroRNAs (miRNAs) zwischen Zellen und HDL-miRNAs sind Krankheit signifikant verändert. Hier Detail, das wir ein neues Protokoll, das Tandem-HDL-Isolierung mit Dichte-Ultrazentrifugation (DGUC) und Fast-Protein-Flüssigchromatographie (FPLC) verwendet zu erhalten hochreine HDL für Downstream-Profilierung und Quantifizierung aller sRNAs, einschließlich miRNAs, die beide hoch mit -throughput Sequenzierung und Real-Time-PCR-Ansätze. Dieses Protokoll wird eine wertvolle Ressource für die Untersuchung von sRNAs auf HDL sein.
Introduction
Die extrazelluläre nicht-kodierende kleine RNAs (sRNAs) stellen eine neue Klasse von Krankheit Biomarker und potentielle therapeutische Targets und wahrscheinlich erleichtern Zell-zu-Zell - Kommunikation 1. Die am häufigsten untersuchten Typ von sRNA sind Mikro - RNAs (miRNAs) , die etwa 22 nts lang sind und aus längeren Vorläuferformen und primären Transkripte 2 verarbeitet. miRNAs wurden posttranskriptionell demonstriert die Genexpression durch Unterdrückung der Proteintranslation und die Induktion von mRNA - Abbau 2 regulieren. Dennoch sind miRNAs nur eine von vielen Arten von sRNAs; wie sRNAs kann von den Eltern tRNAs (tRNA-derived sRNAs, TDR), small nuclear RNAs (sRNA-derived sRNAs, sndRNA), kleine nucleolar RNAs (snoRNA abgeleitete sRNAs, snRNA), ribosomale RNAs (rRNA-abgeleitete sRNAs gespalten werden, RDR ), Y RNAs (yDR) und verschiedene andere RNAs 1. Einige Beispiele dieser neuartigen sRNAs wurden berichtet miRNAs ähnlich zu funktionieren; jedoch die biologische funktionen vieler dieser bleibt sRNAs bestimmt werden, obwohl Rollen in Genregulation 3-6 wahrscheinlich sind. Interessanterweise sind miRNAs und andere sRNAs stabil in extrazellulären Flüssigkeiten, einschließlich Speichel, Plasma, Urin und Galle. Extrazellulärem sRNAs wahrscheinlich von RNasen durch ihre Assoziation mit extrazellulären Vesikeln (EV), Lipoproteine und / oder extrazellulären Ribonukleoprotein-Komplexe geschützt.
Zuvor haben wir berichtet , dass Lipoproteine, nämlich High-Density - Lipoproteine (HDL), Transport miRNAs in Plasma 7. In dieser Studie wurden HDL unter Verwendung einer sequenziellen Methode der Dichte-Gradienten-Ultrazentrifugation (DGUC) isoliert, schnell-Protein-Flüssigchromatographie (Grßenausschlußchromatographie Gelfiltration, FPLC) und Affinitätschromatographie (anti-Apolipoprotein AI (ApoA-I) Immunpräzipitation 7). Mit beiden real-time PCR-basierten Low-Density-Arrays und einzelne miRNA-Assays wurden miRNA Ebenen auf HDL quantifiziert isoliert von heilendeine und hypercholesterolemic Themen 7. Mit diesem Ansatz konnten wir miRNAs zu profilieren und spezifischen miRNAs in hochreiner HDL Vorbereitungen zu quantifizieren. Seit 2011 haben wir festgestellt, dass, obwohl die Affinitätschromatographie HDL Reinheit verbessert, Antikörpersättigung Ausbeute stark begrenzt und kann kostspielig sein. Derzeit empfiehlt unser Protokoll einen zweistufigen sequentiellen Tandemverfahren DGUC durch FPLC gefolgt, die auch hochwertige HDL Proben für Downstream-RNA-Isolierung und Quantifizierung sRNA erzeugt. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der Hochdurchsatz - Sequenzierung von sRNAs (sRNAseq), zB miRNAs, und das erhöhte Bewusstsein für andere nicht-miRNA sRNA Klassen ist sRNAseq die aktuellen State-of-the-art in miRNA und sRNA Profilierung. Als solches unser Protokoll empfiehlt miRNAs und andere sRNAs auf HDL-Proben unter Verwendung von sRNAseq zu quantifizieren. Dennoch kann Gesamt-RNA aus HDL isoliert auch einzelne miRNAs und andere sRNAs oder validieren sRNAseq Ergebnisse mit real-time PCR eine Quantifizierung verwendet werdenpproaches. Hier beschreiben wir ausführlich ein Protokoll für die Erfassung, Reinigung, Quantifizierung, Datenanalyse und Validierung von hochreinem HDL-sRNAs.
Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, die Machbarkeit und den Prozess der sRNA Quantifizierung in hochreiner HDL aus menschlichem Plasma isoliert zu demonstrieren.
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Protocol
1. HDL Reinigung (~ 5,5 Tage)
- Density-Ultrazentrifugation (DGUC, ~ 5 Tage)
- In 90 ul 100x Anti-Oxidantien zu 9 ml Plasma isoliert aus frischem venösen Blut.
- Einstellen Plasmadichte mit KBr von 1,006 g / ml bis 1,025 g / ml durch Zugabe von 0,251 g KBr bis 9 ml Plasma aus Schritt 1.1.1 (0,0278 g / ml KBr Plasma). Schaukeln Sie das Plasma, bis alle das Salz bei Raumtemperatur aufgelöst ist, und Rohre zu Ultracentrifuge und sicherzustellen, dass alle Blasen nach oben steigen.
- Biegen Sie die Spitze eines 18-G-Nadel auf 90 ° 1 cm von der Spitze, mit Blick auf Kegel Seite nach oben. Unter Verwendung einer Spritze und die 18-Gauge - Nadel, legen Sie vorsichtig 3 ml Overlay - Lösung # 1 über die Plasma (Tabelle 1).
HINWEIS: Die gebogene Nadel sorgt für all die VLDL / IDL, LDL und HDL mit dem Overlay entfernt werden ohne Mischen. - Entfernen Sie die Mehrheit der Blasen an der Spitze, so dass 2 - 3 mm Abstand Meniskus an die Spitze des Rohres und carefully Die Röhrchen in SW-40Ti Eimer.
- Wiegen jeder Eimer (mit den Kappen) auf die Waage, und genau mit dem anderen Eimer (Eimer + cap) Balance: # 1 bis # 4, # 2 bis # 5 und # 3 bis # 6.
Hinweis: Diese Eimer müssen jederzeit ausgeglichen und abgestimmt sein. - Platzieren Rotor in Ultrazentrifuge (Materialliste). Zentrifuge bei 274.400 xg für 24 h bei 4 ° C mit einem # 4 Zwischenbremse.
- Entfernen Sie vorsichtig Eimer aus Rotor und die Rohre aus Eimern.
- Entfernen Sie vorsichtig 2 ml aus der oberen Schicht der Auflage einer Spritze und gebogenen Nadel. Dies wird die VLDL / IDL-Fraktion sein, die bei 4 gelagert werden kann -80 ° C oder ° C.
- die VLDL / IDL-Fraktion, sammeln die restlichen 7 mL Probe (Plasma) und legen Sie es in eine 15 ml konischen Röhrchen Nach dem Entfernen. Bringen Sie das Volumen der Probe bis zu 9 ml mit Overlay - Lösung # 2 (Tabelle 1).
- Stellen Sie die Probendichte von 1,025 g / ml bis 1,080 g / ml mit KBr mitca. 0.746 g KBr in 9 ml Probe oder 0,0828 g / ml KBr Probe. Schütteln Sie die Probe, bis das gesamte KBr gelöst (ca. 20 min) und das Übertragungsrohr zu Ultracentrifuge während sichergestellt Blasen nach oben steigen.
- Mit Spritze und Nadel, legen Sie vorsichtig 3 ml Overlay - Lösung # 3 über die Probe (Tabelle 1). Lassen Sie 2 - 3 mm Abstand Meniskus an die Spitze des Rohres.
- Entfernen Sie die Mehrheit der verbleibenden Blasen am oberen Ende des Rohres und legen Sie sorgfältig die gefüllten Ultra Rohre in SW-40Ti Eimer.
- Wiegen jeder Eimer (mit den Kappen) auf die Waage, und genau mit dem anderen Eimer + Kappe balancieren, wie in 1.1.5.
- Platzieren Rotor in Ultrazentrifuge (siehe Materialliste). Zentrifuge bei 274.400 xg für 24 h bei 4 ° C mit einem # 4 Zwischenbremse.
- Entfernen Sie vorsichtig Eimer aus Rotor und die Rohre aus Eimern.
- Entfernen Sie vorsichtig 2 ml aus der oberen Schicht der Auflage unter Verwendung einer Spritze und seinnt Nadel. Dies wird die LDL-Fraktion sein, die bei 4 gelagert werden kann -80 ° C oder ° C.
- Nach der LDL-Fraktion zu entfernen, sammeln die verbleibenden annähernd 7 ml Probe (Plasma) und legen Sie sie in ein neues 15 ml konischen Röhrchen. Bringen Sie das Volumen der Probe (Plasma) bis zu 9 ml mit 1,080 g / ml - Lösung # 4 (Tabelle 1).
- Stellen Sie die Probendichte von 1,080 g / ml bis 1,30 g / ml KBr unter Verwendung 3,33 g KBr in 9 ml Probe (Plasma) oder 0,37 g KBr pro ml Probe. Rock oder leicht die Probe rühren, bis das gesamte KBr (Salz) aufgelöst ist, und Rohr Ultracentrifuge.
- Mit Spritze und Nadel, legen Sie vorsichtig 3 ml Overlay - Lösung # 5 über die Probe (Tabelle 1).
- Entfernen Sie die Mehrheit der verbleibenden Blasen an der Spitze des Rohres, 2- 3 mm Abstand Meniskus an die Spitze des Rohres zu verlassen und sorgfältig legen die gefüllten Ultra Rohre in SW-40Ti Eimer.
- Wiegen Sie jede Schaufel (mit den Kappen) auf die Waage, und genau mit dem anderen Eimer + Kappe, wie in 1.1.5 balancieren.
- Platzieren Rotor in Ultrazentrifuge (siehe Materialliste). Zentrifuge bei 274.400 xg für 48 h bei 4 ° C mit einem # 4 Bremse.
- Entfernen Sie vorsichtig Eimer aus Rotor und die Rohre aus Eimern.
- Entfernen Sie vorsichtig mit einer Spritze und verbogene Nadel ca. 2 ml aus der oberen Schicht des Overlays verwenden. Dies ist der HDL-Fraktion, die bei 4 ° C oder -80 ° C gelagert werden kann.
HINWEIS: Nach DGUC HDL kann die Hochsalzlösungen zu entfernen dialysiert werden. - Um dialysiere, legen Sie die gesammelten HDL-Fraktion in einem verschlossenen Dialysehülse (10.000 MW cut-off) und über Nacht in 1 L 1x PBS dialysiert. Ändern Dialysepuffer (1x PBS) 3-mal mehr als 24 Stunden. Sanfte Störung des PBS mit einem magnetischen Rührstab wird die Dialyse zu verbessern.
- Bestimmung der Proteinkonzentration des DGUC-HDL 8 ein BCA - Methode.
- Schnell-Protein Liquid Chrographie (FPLC) oder Grßenausschlußchromatographie (~ 6 h)
- Filter 1,2 mg DGUC-HDL (Gesamtprotein) in 500 & mgr; l durch einen 0,22 & mgr; m Mikrozentrifugenfilter (siehe Liste der Materialien), unmittelbar vor der Injektion.
HINWEIS: Eine zusätzliche Filterung des DGUC-HDL Probe durch ein 0,45 um-Mikrozentrifugenfilter vor dem 0,22 um-Filter kann für einige Proben erforderlich sein. - Sammeln Sie die gefilterten DGUC-HDL-Probe, laden Sie die FPLC (Füllung) Injektionsspritze, und sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der Spritze sind, bevor sie in die FPLC injiziert wird.
- Stellen Sie die FPLC Flussrate auf 0,3 ml / min bei einer Druckgrenze bei 2,6 MPa. Äquilibrieren Säulen mit 0,2 Säulenvolumen (ca. 15 ml) der Puffer vor Injektion abzutasten. Injizieren Sie die Probe mit 3 ml Puffer in die FPLC (Injektionsschleife) Instrument und den Lauf starten. Sammeln 1,5-ml-Fraktionen für insgesamt 72 Fraktionen.
- Filter 1,2 mg DGUC-HDL (Gesamtprotein) in 500 & mgr; l durch einen 0,22 & mgr; m Mikrozentrifugenfilter (siehe Liste der Materialien), unmittelbar vor der Injektion.
2. Hochdurchsatz-Small RNASequenzierung (sRNAseq, ~ 9 Tage)
- RNA - Isolierung (~ 1 Tag)
- Identifizieren der FPLC-Fraktionen DGUC-HDL entspricht, die von Gesamt-Cholesterinspiegel Bestimmen eines kolorimetrischen Kits nach den Anweisungen des Herstellers. Mit dieser FPLC Set-up, erwarten zu finden 6 - 7 FPLC Fraktionen, die DGUC-HDL.
- Sammle alle Volumen (ca. 8 -1 0 ml Pool von 1,45 ml Fraktionsvolumina) von DGUC-HDL FPLC-Fraktionen und konzentriere unter Verwendung von 10 kDa MG Rückhalte Zentrifugalfilter Einheiten bei 4.000 × g für 1 h bei 4 ° C oder bis HDL Konzentrat beträgt etwa 100 & mgr; l.
- Sammeln Sie die HDL - Konzentrat und quantifizieren HDL Gesamtproteinkonzentration 8 der BCA - Methode.
- Bestimmen die höchste Konzentration an HDL Gesamtprotein, bis zu 1 mg, die aus jeder Probe in dem Satz aliquotiert werden kann. B. Isolierung für jede Probe RNA aus der gleichen Menge an HDL Gesamtprotein.
- Führen RNA-Isolierung verwendetein modifiziertes Protokoll (siehe Liste der Materialien).
- In 10x Volumen Phenol Lysereagenz (siehe Liste der Materialien) Probe und Vortex für 1 min.
- Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
- In Chloroform (20% Reagenz Volumen in Schritt 2.1.5.1 verwendet Phenol Lyse) und kräftig schütteln, 15 s.
- Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 - 3 min.
- Zentrifuge für 15 min bei 12.000 × g bei 4 ° C in einer Kühlzentrifuge.
- Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen, die Vermeidung der Interphase.
- Hinzufügen 1,5x Volumen von 100% Ethanol zu der wässrigen Phase und vortex für 1 min.
- Store Proben für mindestens 1 h oder über Nacht bei -80 ° C.
- Fahren Sie mit dem RNA-Isolierung Protokoll der mitgelieferten Mini-Spalten verwenden.
- Eluieren mit 30 & mgr; l RNase-freiem H 2 O. Erste hinzuzufügen 15 ul H 2 O direkt auf die Fritte, Schleudern bei niedriger Geschwindigkeit (2000 × g) für 2 min, undSpin dann bei hoher Geschwindigkeit (max) für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt mit zusätzlichen 15 & mgr; l H 2 O
- Fahren Sie direkt mit sRNA Bibliothek Generation oder bei -80 ° C.
- Bibliothek Generation (~ 6 h)
- Bereiten Sie sRNA cDNA-Bibliotheken, die sRNA Bibliothek Generation Kit-Protokoll, als den Anweisungen des Herstellers mit einer Modifikation der PCR-Amplifikation wie nachfolgend beschrieben.
- Bereiten Sie die PCR - Mastermix auf Eis mit 0,5 ul DNase / RNase-freiem H 2 O, 15 & mgr; l PCR - Mix (PML) und 1 & mgr; l RNA - PCR - Primer (RP1) pro Probe (einen zusätzlichen 10% zum Pipettieren Fehler).
- In 16,5 ul der PCR-Mix zu jedem (cDNA) Probe.
- einen Index / Barcode-Nummer zu jeder Probe zum Multiplexen zuweisen und 1 & mgr; l PCR Primer Index (auf die entsprechende Nummer) zu der Probe hinzuzufügen.
- Führen Sie eine schnelle Drehung der Mikrofuge verwenden.
HINWEIS: Das Gesamtvolumen solltejetzt 30 ul pro Probe sein. - Führen Sie die Zyklusbedingungen für die PCR - Amplifikation wie in den Tabellen 2 und 3 aufgeführt.
- Bereiten Sie sRNA cDNA-Bibliotheken, die sRNA Bibliothek Generation Kit-Protokoll, als den Anweisungen des Herstellers mit einer Modifikation der PCR-Amplifikation wie nachfolgend beschrieben.
- Größe auswählen sRNA - Bibliothek zu entfernen Adapter: Adapter (~ 1,5 h)
- Führen Sie Größe der Bibliothek-Auswahl unter Verwendung einer automatischen DNA-Größenwähler gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Größenparameter: Ziel: 156 bp, Beginn: 135 bp, Ende: 177 bp, Bereich Flag: Breit.
- DNA Clean Up (~ 0,5 h)
- Clean up größenselektierten sRNA cDNA gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Eluieren sauber und konzentriert sRNA cDNA mit 2 x 7 ul DNase / RNase-freiem H 2 O.
- Quantifizieren und Beurteilen sRNA cDNA - Bibliothek Ertrag und Qualität (~ 1 h)
- Beurteilen Sie sRNA cDNA-Bibliothek Qualität und Größe unter Verwendung eines hochempfindlichen DNA-Chip auf einem Bioanalyzer (Materialliste) gemäß manufacturer Anweisungen.
- Quantifizieren der einzelnen sRNA cDNA-Bank-Konzentrationen unter Verwendung eines hochempfindlichen DNA-Test (Materialliste), gemäß den Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Es wird empfohlen, alle Proben mit unterschiedlichen Indizes haben auf der gleichen Spur der Flusszelle, wenn möglich ausgeführt werden. Wenn mehr als eine Spur erforderlich ist, mischen Fall und Kontrollproben geeignet.
- Hochdurchsatz - Sequenzierung sRNA (~ 7 Tage)
- Pool einzelne indiziert sRNA Bibliotheken basierend auf äquimolare Konzentrationen.
- Bildschirm gepoolt sRNA Bibliotheken für Qualität mit hoher Empfindlichkeit DNA-Chip auf der Bioanalyzer und bestimmen Bibliothek DNA-Konzentration wie in 2.5.1 - 2.5.2.
- Führen quantitative PCR (qPCR) des Adapters geeignete Inhalte Sequenzierungstiefe mit Hilfe der Sequenzierung Bibliothek qPCR Quantifizierung Kit, um sicherzustellen, laut Herstellerangaben (Materialliste).
- Führen Sie die Sequenzierung eines einzelnen Lese verwenden, 50 b25 M liest / Probe, gemäß den Anweisungen des Herstellers - p-Protokoll eine Tiefe von etwa 20 zu erreichen.
3. Datenanalyse (~ 1 Tag)
- Verwenden Sie bcl2fastq2, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen vorverarbeiten rohen fastq Dateien von demultiplexten Proben (Materialliste).
- Verwenden Sie Cutadapt zu trimmen Adapter 9 und entfernen Sie liest <16 Nukleotiden (nts) in der Länge, wie pro Benutzerhandbuch Anweisungen (Materialliste).
- Entfernen Kontamination Sequenzen, die in den sRNA Bibliotheken, einschließlich Stop-Lösung Sequenz (STP: CCACGTTCCCGTGG) und Adapter Übertrag (CTACAGTCCGACGATC) mit removeSequenceInFastq Funktion in NGSPERL Rahmen, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen (Materialliste).
- Führen Sie die Qualitätskontrolle Metriken von FastQC mit Center for Quantitative Sciences (CQS) Werkzeuge, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen (Materialliste).
- Generieren Sie nicht redundante Liste der "identisch" liest (Zusammenbruch redundant liest) und Zahlen Rekordkopie CQSTools, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen (Materialliste).
- Richten Sie liest menschlichen Genoms Bowtie1.1.2 ermöglicht ein Mismatch (Optionen: -a -m 100 --bester --strata -v 1), pro Benutzerhandbuch Anweisungen (Materialliste).
- Führen Sie lesen Ausrichtung, Zählen, und führen Verdichtungsaufgaben mit NGSPERL, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen.
- Konvertieren Sie exportierte Zählung Tabelle in ein Tabellenkalkulationsdatei.
- Normalisieren liest einer bestimmten Klasse (zB miRNAs) zur Gesamtzahl der für diese Klasse lautet (zB Gesamtzahl der miRNAs liest) und Bericht - Signale als Lesevorgänge pro Mapped miRNA (RPMM). (ZB RPMM = (miR-X / Gesamtanzahl von miRNA liest) * 1.000.000).
- Eingang normalisiert Zählung Tabelle als generische einzelne Farbtechnologie in Software für Low-Level-und High-Level-Differenzanalysen gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen (Materialliste).
HINWEIS: Zur Zeit gibt es keine gut charakterisierten Housekeeping-Gene / SRNWie für HDL-sRNA. Ein Spike-Kontrolle kann verwendet werden, kann aber problematisch sein. Normalisieren zum Gesamtprotein Eingang oder Volumen wird empfohlen, HDL. Am wichtigsten ist, ist es empfehlenswert, Sequenzierungsergebnisse von einem der verschiedenen Strategien zur Validierung miRNAs und sRNAs mittels real-time PCR oder quantitative PCR quantifiziert werden.
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Representative Results
Dieses Protokoll ist eine Reihe von etablierten Methoden miteinander verbunden sind für die Quantifizierung von sRNAs auf hochreine HDL durch Hochdurchsatz - Sequenzierung oder Echtzeit - PCR (1) zu ermöglichen. Um die Machbarkeit und die Auswirkungen dieses Protokoll zeigen, HDL wurde aus Humanplasma durch das Tandem DGUC und FPLC-Methode gereinigt. Collected FPLC-Fraktionen zu HDL (von Cholesterinverteilung) wurden konzentriert, und Gesamt-RNA wurde aus 1 mg von HDL (Gesamtprotein) isoliert. sRNA-Bibliotheken wurden mit HDL von n = 4 gesunden Probanden gesammelt erzeugt. Alle menschlichen Blut / Plasmaproben wurden im Rahmen einer aktiven Institutional Review Board-Protokoll (# 070416) gesammelt und menschlichen Probanden wurden mit Einverständniserklärung eingeschrieben als von der Vanderbilt University School of Medicine zugelassen. Vorbereitet sRNA-Bibliotheken wurden an der Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics (VANTAGE) DNA-Sequenzierung Zentrum und Daten sequenziert Analysen wurden durchgeführtInhouse-Pipelines verwenden. Daten-Visualisierungen wurden durch die grafische Darstellung Software erstellt wurden.
Die kritische Notwendigkeit, eine zweite Methode (FPLC) für HDL-Isolation nach DGUC auszuführen ist wegen möglicher Co-Reinigung von EVs. EVs sind eine verallgemeinerte Klasse von Membran abgeleitetes Vesikel , die 10 von multivesikulären Körpern (Exosomen), Plasmamembran Knospung (Mikrovesikel) und andere Prozesse, einschließlich apoptotischen Körpern stammen. (- 1,21 g / mL 1,063) nach DGUC 11,12 EVs, nämlich Exosomen, wurden in der HDL Dichte Fraktion vorhanden sein , um eine ähnliche Dichte wie geringe HDL (2A), haben berichtet , und somit könnte. Um EVs und andere Lipoproteine (zB LDL) zu entfernen, aus DGUC-HDL wurde FPLC zur Trennung von HDL von anderen Vesikeln und Partikeln nach Größe verwendet werden; HDL (7 bis 12 nm im Durchmesser) und EVs (40-220 nm Durchmesser) sind aufgrund ihrer Größe Unterschiede (2A, B) leicht fraktioniert. HDL-Fraktions waren leicht aufgrund der Verteilung von Cholesterin offensichtlich und DGUC-HDL FPLC-Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert 10 kDa cut-off Zentrifugation Filtern. Konzentrierte HDL wurden für nachgeschaltete RNA - Analyse (2B) gesammelt und verwendet wird . Um dies zu verdeutlichen, Plasma-Pre-DGUC wurde unter Verwendung von FPLC und die Verteilung der Phospholipide (Phosphatidylcholin, PC) fraktioniert; Gesamtcholesterin (TC), und Protein-Ebene wurden in Fraktionen quantifiziert und aufgezeichnet. PC, TC und Proteine Spiegel wurden drei farbmetrischen Kits quantifiziert. Alle drei Parameter definiert klar die HDL-Fraktionen (19-24) und VLDL / LDL-Fraktionen (14 bis 18). In FPLC fraktioniert Plasma, Protein- und Lipidsignale wurden minimal erkannt oder gar nicht in Fraktionen zu detektierenden Vesikel entsprechenden Größen größer als VLDL (links von Orange Box) (3A). Um zu demonstrieren, DGUC Trennung von HDL, DGUC-HDL wurde fraktioniert durch FPLC und PC, TC, und Proteine Spiegel waren quantified (3B). diese Werte Plotten veranschaulicht die Co-Fraktionierung einer geringen Menge an LDL unter Verwendung DGUC und verstärkt die Notwendigkeit, das tandem DGUC-FPLC Ansatz verwenden hochreines HDL zu isolieren. Obwohl EVs vorhergesagt werden mit HDL Co-fraktionieren während DGUC, gab es zu keiner wenig in der Lipid- und Protein in den Fraktionen entsprechenden Größen zu Bläschen mehr als LDL (3B). Der EV Lipid- und Proteinsignatur im Größenbereich auch vorhergesagt, von DGUC-VLDL minimal nachweisbar ist oder fehlt und DGUC-LDL, wenn sie durch FPLC fraktioniert (Daten nicht gezeigt). Für die RNA-Analyse wurde von 1 mg Tandem gereinigt HDL für sRNA Bibliothek Generation Gesamt-RNA isoliert. Kurz gesagt wurden die Adapter an die 3 ligiert 'und 5' - terminalen Enden sRNAs einschließlich miRNAs und TDRs (4A). Ligierten Produkte wurden revers transkribiert (RT) und PCR amplifizierten PCR unter Verwendung von Primern beherberge spezifischen Indizes ausgelegt zum Multiplexen Proben während Downstream Sequenzierungsreaktionen (4A). Jeder Adapter ist 61 nts in der Länge; also eine ligierte miRNA (ca. 22 nts in der Länge) würde ein Produkt von 144 nts in Länge herzustellen. Viele nicht-miRNA sRNAs sind etwas länger als miRNAs (beispielsweise 30 - 35 nts in der Länge). Als solche war unsere gezielte Produktlänge 156 bps in der Länge. Amplifizierte Produkte waren größenselektierten eine automatische DNA - Größenwähler und alle cDNA - Produkte 135-177 bps lang gesammelt wurden (4A). Die Qualitäten von größenselektierten Bibliotheken wurden von hochempfindlichen DNA - Chips mit dem Bioanalyzer (4B) beurteilt. sRNA cDNA-Bibliotheken dieser Größe erschien etwas größer wegen der möglichen Auswirkungen bei der Analyse "sprudelt". Für gemultiplexte Sequenzierung, wurden äquimolare Konzentrationen von cDNA - Bibliotheken gepoolt, gereinigt, konzentriert und unter Verwendung der Bioanalyzer (4B) erneut analysiert. Die Multiplex-Probe wurde dann Sequenunter Verwendung eines einzigen 50 bp-Protokoll gelesen ced. In-house wurden Datenanalyse Pipelines Proben auf Indizes basieren auf demultiplexen, Trimm-Adapter, führen Qualitätskontrolle Metriken, um das menschliche Genom ausrichten und mit Anmerkungen versehen sRNAs zählen. Die Verteilung der normierten liest (Lesevorgänge pro Million, RPM),> 16 nts Länge veranschaulichen die Anreicherung von sRNAs 20-22 nts in der Länge und 34 bis 35 nts lang auf HDL (4C).
Ausrichtung und Zählen Analyse der vier HDL-sRNA - Bibliotheken gefunden , dass 38% von Reads zu annotierten Regionen des menschlichen Genoms ausgerichtet waren miRNAs (5A). Ebenso reichlich (37%) waren sRNAs-abgeleitet von tRNAs (TDR). sRNAs stamm aus verschiedenen RNAs (zB Y RNAs), rRNAs, smRNAs, snoRNAs, und lange nicht-kodierenden RNAs (lincRNAs) waren ebenfalls anwesend auf HDL (5A). Nach Normierung auf die Gesamtzahl der liest für jede Klasse, die Top 50 am häufigsten miRNAs (Lesevorgänge pro miRNA Mapped, RPMM, 5B), TDR (Lesevorgänge pro Mapped TDR, RPMT, 5C), und andere nicht-miRNA nicht tDR sRNAs (Liest Per Mapped sRNA, RPMS, 5D) wurden von Heatmaps organisiert . Diese Daten veranschaulichen die Ähnlichkeiten (beispielsweise HDL-miRNAs) und Abweichungen (beispielsweise TDR) der am häufigsten vorkommenden HDL-sRNAs in gesunden Probanden (5B-D). Diese Ergebnisse zeigen die Kraft dieser Strategie und Protokoll bemerkenswerte Einblicke in den Transport von sRNAs von HDL zu liefern. Trotzdem sollte sRNA Sequenzierung nicht für die absolute Quantifizierung herangezogen werden. sRNAs von Interesse sollte durch Echtzeit-PCR validiert werden. Ebenso können viele Forscher nur die Quantifizierung einzelner miRNAs auf HDL erfordern. Als solches wurde die Gesamt-HDL-RNA aus jedem Fach isoliert für relative Quantifizierung von HDL-miRNAs mit real-time PCR. Fünf der häufigeren miRNAs entdeckt auf HDL von sRNAseq wurden für REAl-time PCR - Assays ihre Ebenen auf jeder HDL Probe (5E) zu bestimmen. (- ΔCtArb RQV = 2) und normalisiert auf 1000 ug HDL Proteineintrag in die RNA - Isolierung 13 die relativen quantitativen Werte wurden unter Verwendung eines beliebigen housekeeping Ct von 32 berechnet. Die Ergebnisse der Echtzeit-PCR-Studie zeigen, dass dieses Protokoll bei der Aufdeckung von HDL-miRNAs und Quantifizierung von Unterschieden zwischen den Individuen auch wertvoll ist. Gemeinsam definieren die vorgestellten Schemata, die kritischen Details der Verfahren und die Ergebnisse sowohl von Hochdurchsatz-Sequenzierung und Real-Time-PCR-Ansätze stellen die Leistungen dieses Protokolls.
Abbildung 1. Repräsentative Flussdiagramm des Protokolls. Reines HDL aus Dichte-Ultrazentrifugation und fast protein liquid Chromatog isoliert graphie. Insgesamt HDL - RNA kann dann für kleine RNA (sRNA) Sequenzierung verwendet werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Isolierung von HDL. (A) Diagramm der Dichte und der Durchmesser der Lipoproteine und extrazellulären Vesikeln (EV). (B) Schematische Darstellung der sequentiellen Tandem HDL Isolierung, einschließlich Plasmaseparation, Dichte-Ultrazentrifugation (DGUC), Fast-Protein (FPLC), Filtration und Konzentration. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3. Schnell-Protein - Flüssigchromatographie (FPLC) Die Trennung der Lipoproteine EV, extrazellulären Vesikeln. VLDL, sehr geringer Dichte Lipoproteine; LDL, Low-Density-Lipoproteine; HDL, High-density-Lipoproteine; FP, freies Protein; PC, Phosphatidylcholin; und TC, Gesamtcholesterin. Rote Linie, TC; Blaue Linie, Eiweiß und schwarze Linie, PC. Die Trennung von Lipoproteinen aus (A) Humanplasma vor der Dichte-Ultrazentrifugation (DGUC) und (B) HDL - Fraktion nach DGUC. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Generation kleiner RNA - Bibliotheken. (A) Schematische Darstellung der kleinen RNA (sRNA) Bibliothek construction und Größenauswahl. miRNA, microRNA; tDR, tRNA-derived sRNAs; sRNA, nicht-miRNA nicht tDR sRNAs; RT, reverse Transkription; bp, Basenpaar; und cDNA, kloniert DNA. (B) Analyse von HDL-sRNA Bibliotheken vor und nach der Verwendung von Multiplexing hochempfindlichen DNA - Chips und Bioanalyzer. (C) Länge Verteilung von HDL-sRNA liest nach Sequenzierung. RPM, Lesungen pro Million; M, männlichen Probanden; F, weibliche Probanden; und nt, Nukleotid. N = 4. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Die Vielfalt der HDL-sRNAs. (A) Verteilung der HDL-sRNAs über sRNA Klassen. Fraktion von Reads zu annotierten sRNAs im menschlichen Genom ausgerichtet sind. (BD) mc_ui_heatmap N = 4 HDL-sRNA Proben.
| 1. Anti-Oxidantien für Lipoprotein Trennung | Machen Sie Stammlösung bei 100x |
| EDTA | Ethylendiamintetraessigsäure (0,5 M Lager) |
| AZT | 3-Amino-1,2,4-triazol: 42 mg / ml H 2 O |
| BHT | Butylhydroxytoluol: 25 mg / 100 ul EtOH |
| Trolox | (+) - 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carbonsäure: 41,7 mg / 500 & mgr; l EtOH |
| 2. Overlay - Lösungen | |
| Lösung 1 | 1,019 g / ml in H 2 O |
| Lösung 2 | 1,025 g / ml KBr / H 2 O |
| Lösung 3 | 1,063 g / ml KBr / H 2 O |
| Lösung # 4 | 1,080 g / ml KBr / H 2 O |
| Lösung # 5 | 1,255 g / ml KBr / H 2 O |
| 3. FPLC Buffer | </ Tr> |
| 1 L-Rezept | 50 ml 3 M NaCl; 20 ml 0,5 Tris-HCl, pH 7,6; 2 ml 10% NatriumAzid; 930 mL H 2 O |
Tabelle 1. Spezielle Reagenzien.
| Stufe | Temp (° C) | Zeit | Fahrräder |
| EIN | 98 | 30 s | 1 |
| B | 98 | 10 s | 25 |
| 60 | 30 s | ||
| 72 | 15 s | ||
| C | 72 | 10 Minuten | 1 |
Tabelle 2.Von Bibliotheken Amplifizierungsschritte.
| Grundierung | Sequenz |
| Primer 1.1 | AATGATACGGCGACCACCGAGAT |
| Primer 2.1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
Tabelle 3. PCR - Primer.
| Stufe | Temp (° C) | Zeit | Fahrräder |
| EIN | 95 | 10 Minuten | 1 |
| B | 95 | 10 s | 40 |
| 60 |
Tabelle 4. Bibliothek Quantifizierung Amplifizierungsschritte.
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Discussion
Dieses Protokoll wurde entwickelt miRNAs und andere sRNAs durch Hochdurchsatz-Sequenzierung oder Real-Time PCR auf hochreines HDL zu quantifizieren. Wie bei jedem Ansatz sollte besondere Überlegungen zu jedem Schritt in dem Verfahren zur Reinigung von HDL und RNA und dann sRNAs Quantifizieren gegeben werden. Dieses Protokoll wird für Projekte mit ≥ 2 ml Plasma gestartet wird. Dennoch können qualitativ hochwertige RNA Analysen erfolgreich mit HDL von so wenig wie 80 & mgr; l des menschlichen oder Maus-Plasma unter Verwendung von Affinitätschromatographie gereinigt abgeschlossen werden; erzeugen jedoch größere Ausgangsplasmavolumen die Methoden besser hier präsentierten Daten verwenden. Probenbearbeitung und Extraktionsmethoden drastisch miRNA / sRNA Qualität und Ausbeute zu verändern. Die Verwendung von Antikoagulantien, während wesentlich zur Plasmagewinnung, wirkt sich wahrscheinlich Downstream-Extraktion. Zum Beispiel wird Heparin nicht leicht während der RNA - Extraktion 14,15, entfernt und 16-18 in PCR verwendet nachgeschalteten Enzyme hemmen können. Zusätzlich there gibt Berichte , dass Natriumcitrat auch mit qPCR Messungen stören können , wo miRNAs aus EDTA - Proben haben gezeigt , um Expressionsprofil verbessert im Vergleich zu Natriumcitrat Proben 16,19,20. Diese Studien zeigen die Notwendigkeit einer sorgfältigen Überlegung, wenn ein Antikoagulans der Wahl. Darüber hinaus aufgrund der erhöhten Potential für Zelllyse während der Koagulation werden Serumproben nicht lysierten Zell miRNAs empfohlen künstlich mit Lipoproteinen assoziieren kann. Ebenso wird Plasma idealerweise unmittelbar aus Vollblut isoliert Kontamination von anderen peripheren Blutzellen zu vermeiden, einschließlich lysierten Leukozyten. Als kalte Temperatur allgemein bekannt ist, die Plättchenaktivierung, Vollblutproben werden versponnen weg von Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten bei 3.000 xg für 15 min bei Raumtemperatur zu beeinflussen. Hämolyse ist auch schlecht beraten , als gebrochen Erythrozyten berichtet auch miRNA Ergebnis zu beeinflussen 21,22, da sie miRNAs enthalten , die während der hemol vergossen werden kannlyse 23,24. Plasma kann dann für 2 bei 4 ° C gelagert werden - 4 Wochen oder alternativ Plasma bei -80 ° C eingefroren werden können , wo miRNA - Gehalt stabil und tragfähig in kurzfristige und langfristige Lagerung (maximal 4 Jahre) 25 ist. Um unserem derzeitigen Kenntnisstand, das Einfrieren Plasmaproben nicht zu schaden vorhergesagt HDL-miRNAs und gefrorenen Plasmaproben geeignet sind zu analysieren. Als Lipoproteine und andere Vollblutkomponenten kann durch Nahrungsaufnahme nicht beeinträchtigt werden, wird das Fasten Blutentnahme bevorzugt.
Wie oben erwähnt, kann Plasma HDL durch eine Anzahl von Standardverfahren isoliert werden, einschließlich DGUC, FPLC und Affinitätschromatographie gegen ApoA-I. . Isolierung von Plasma - Lipoproteinen durch DGUC KBr verwendet, wie von Redgraves et al 26, trennt VLDL (d = 0,94 bis 1,006 g / ml), LDL (d = 1,006-1,063 g / ml) und HDL (d = 1,063 bis 1,21 g / ml) und ist eine ideale Methode für große Mengen von Plasma (2-60 ml pro Probe). Die BegrenzungAllein dieser Ansatz ist , dass EVs Exosomen und andere miRNA enthalten , haben berichtet eine ähnliche Dichte an HDL und sein kann , in DGUC HDL (2A). Weitere Nachteile sind mögliche strukturelle Schäden an Proteinen aus hoher Salzbelastung in Puffern und starke Ultrazentrifugation Kräfte sowie differentielle Stabilitäten von HDL Unterklassen 27,28. Trotzdem ist DGUC allgemein als es ergibt sich eine hohe Ausbeute an HDL - Protein produzieren nahe 1 mg HDL - Protein pro 1 ml Plasma 29 verwendet. Die FPLC-Ansatz, der Gelfiltration Größenausschluss beinhaltet, benötigt weniger Zeit, abhängig von der Strömungsgeschwindigkeit (ca. 6 h) und eine höhere Genauigkeit hat von apoB-enthaltenden Lipoproteinen (nach Größe) und deren Unterklassen, einschließlich EVs Trennung HDL die viel größer sind als HDL, aber haben ähnliche Dichten. Es sollte beachtet werden, dass die Verfahren, die in diesem Protokoll Plasma Vesikel zwischen etwa 220 detailliert unter Verwendung von - Durchmesser 75 nm nichtein nachweisbares Lipid oder Proteinsignatur entlocken, wenn sie durch FPLC getrennt. Je nach Set-up, FPLC erfordert relativ kleinen Eingang, 0,3-1 ml, die zur Bekämpfung von Nagetieren Plasma und kleine gefrorene Aliquots nützlich ist. Schnell kolorimetrischen Cholesterin-Assays sind ebenfalls wichtige FPLC im Anschluss an die Verteilung von HDL oder anderen Lipoprotein-Fraktionen zu bestätigen. Fraktionierung verdünnt Proben und Lipoproteine; jedoch Proben können dann zentrifugalen größen Filter unter Verwendung von Standard konzentriert werden (zB 10 kDa mw Cut-off - Filter). HDL-Isolation von ApoA-I IP Micro-Spin-Säulen verwenden, sind die schnellste der drei Ansätze, sind aber durch niedrige Eingangs begrenzt (0,08-1 & mgr; l) Volumen und geringer Ausbeute (ca. 0,1 mg). Während ApoA-I IP mühsam sein kann, ist dieses Verfahren mit geringem Volumen Zellkulturüberstände für ideal. Während jedes dieser Verfahren Stärken und Schwächen hat, werden diese , wenn in Tandem verwendet reduziert werden kann (beispielsweise gefolgt DGUC FPLC). Mit Hilfe von zwei Ansätzen in tandem, führt zu einer höheren ReinheitHDL für miRNA und sRNA Analyse.
entweder mit Hochdurchsatz-Sequenzierung oder real-time PCR Hier detailliert wir die erforderlichen Schritte für hochreines HDL mit der Tandem-Methode von DGUC durch FPLC gefolgt zu isolieren und skizziert die Schritte verwendet, HDL-miRNAs und sRNAs zu quantifizieren. Obwohl dieses Protokoll für HDL entworfen wurde, hat es große Anwendbarkeit in sRNAs auf anderen Lipoproteinen Quantifizieren, einschließlich LDL und VLDL, bezogen auf ihre Dichten und Größen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45 µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
