Abstract
La diversità dei piccoli RNA non codificanti (sRNA) è in rapida espansione e il loro ruolo nei processi biologici, tra cui regolazione genica, stanno emergendo. Più interessante, sRNAs si trovano anche al di fuori delle cellule e sono stabilmente presenti in tutti i liquidi biologici. Come tale, sRNAs extracellulari rappresentano una nuova classe di biomarcatori di malattia e sono probabilmente coinvolti nella segnalazione cellulare e reti di comunicazione intercellulare. Per valutare il loro potenziale come biomarcatori, sRNAs possono essere quantificati nel plasma, urine e altri fluidi. Tuttavia, per comprendere appieno l'impatto di sRNAs extracellulari come segnali endocrini, è importante determinare quali vettori trasportano e li protegge nei fluidi biologici (ad esempio, plasma) che cellule e tessuti contribuiscono alle piscine Srna extracellulari, e le cellule e tessuti capaci di accettare e utilizzare extracellulare sRNA. Per raggiungere questi obiettivi, è fondamentale per isolare le popolazioni altamente pure di vettori extracellulariper sRNA profilatura e la quantificazione. Abbiamo precedentemente dimostrato che le lipoproteine, in particolare lipoproteine ad alta densità (HDL), i trasporti microRNA (miRNA) funzionali tra le cellule e HDL-miRNA sono significativamente alterati nella malattia. Qui, abbiamo dettaglio un nuovo protocollo che utilizza tandem isolamento HDL con ultracentrifugazione in gradiente di densità (DGUC) e fast-proteina-cromatografia liquida (FPLC) per ottenere HDL altamente puro per la profilatura a valle e la quantificazione di tutti sRNAs, tra miRNA, utilizzando sia alta sequenziamento -throughput e real-time PCR approcci. Questo protocollo sarà una risorsa preziosa per l'indagine di sRNAs su HDL.
Introduction
Extracellulari non codificante piccoli RNA (sRNAs) rappresentano una nuova classe di biomarcatori di malattia e potenziali bersagli terapeutici e probabilmente facilitare la comunicazione 1 cella-a-cella. Il tipo più ampiamente studiato di sRNA sono microRNA (miRNA), che sono circa il 22 nti di lunghezza e vengono elaborati da forme precursori più lunghi e trascrizioni primari 2. miRNA hanno dimostrato di livello post-trascrizionale regolare l'espressione genica attraverso la soppressione della traduzione di proteine e induzione di mRNA degrado 2. Tuttavia, miRNA sono solo uno dei molti tipi di sRNAs; come sRNAs possono essere scissi dal tRNA controllanti (sRNAs tRNA-derivati, TDR), piccoli RNA nucleari (sRNAs sRNA-derivati, sndRNA), piccoli RNA nucleolari (sRNAs snoRNA-derivati, snRNA), RNA ribosomiale (sRNAs, RDR rRNA-derivati ), Y (RNA YDR), ed altri RNA vari 1. Alcuni esempi di questi nuovi sRNAs sono stati segnalati per funzione simile a miRNA; tuttavia, il fu biologicanctions di molti di questi sRNAs resta da stabilire, anche se i ruoli nella regolazione genica è probabile 3-6. Più interessante, miRNA e altri sRNAs sono stabilmente presenti nei fluidi extracellulari, tra cui la saliva, plasma, urine, e la bile. sRNAs extracellulari sono probabilmente protetti da RNasi attraverso la loro associazione con vescicole extracellulari (EV), lipoproteine, e / o complessi ribonucleoproteici extracellulari.
In precedenza, abbiamo riportato che lipoproteine, cioè lipoproteine ad alta densità (HDL), miRNA di trasporto nel plasma 7. In questo studio, HDL sono stati isolati utilizzando un metodo sequenziale di ultracentrifugazione in gradiente di densità (DGUC), fast-proteina cromatografia liquida (ad esclusione dimensionale gel filtrazione cromatografia FPLC), e cromatografia di affinità (anti-apolipoproteina AI (apoA-I) immunoprecipitazione ) 7. Usando entrambi gli array a bassa densità basati sulla PCR in tempo reale e analisi miRNA individuali, i livelli di miRNA sono stati quantificati sulla HDL isolati da guarirela tua e soggetti ipercolesterolemici 7. Usando questo approccio, siamo stati in grado al profilo miRNA e quantificare miRNA specifici preparati HDL elevata purezza. Dal 2011, abbiamo determinato che, sebbene cromatografia di affinità aumenta HDL purezza, la saturazione degli anticorpi limita fortemente il rendimento, e può essere un costo proibitivo. Attualmente, il nostro protocollo raccomanda un metodo tandem sequenziale in due fasi di DGUC seguito da FPLC, che produce anche i campioni di HDL di alta qualità per il down-stream isolamento RNA e sRNA quantificazione. A causa di recenti progressi nella high-throughput sequenziamento del sRNAs (sRNAseq), ad esempio, miRNA, e la maggiore consapevolezza delle altre classi non miRNA Srna, sRNAseq è l'attuale stato-of-the-art in miRNA e sRNA profiling. Come tale, il nostro protocollo raccomanda miRNA quantificare e altri sRNAs su campioni di HDL utilizzando sRNAseq. Tuttavia, l'RNA totale isolato da HDL può anche essere utilizzato per quantificare i singoli miRNA ed altri sRNAs o convalidare i risultati sRNAseq usando PCR in tempo reale unapproaches. Qui si descrive nel dettaglio un protocollo per la raccolta, la depurazione, la quantificazione, l'analisi dei dati, e la convalida di elevata purezza HDL-sRNAs.
L'obiettivo generale di questo lavoro è quello di dimostrare la fattibilità e il processo di sRNA quantificazione in HDL altamente puro isolato da plasma umano.
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Protocol
1. HDL Purificazione (~ 5,5 giorni)
- In gradiente di densità Ultracentrifugazione (DGUC, ~ 5 giorni)
- Aggiungere 90 ml di 100x antiossidanti a 9 ml di plasma isolati dal sangue venoso fresco.
- Regolare la densità del plasma con KBr da 1.006 g / mL a 1.025 g / mL con l'aggiunta di 0,251 g di KBr a 9 ml di plasma dal punto 1.1.1 (0,0278 g / ml KBr plasma). Rock the plasma finché tutto il sale viene disciolto a temperatura ambiente e trasferimento ultracentrifuge tubi e garantire tutte le bolle salire verso l'alto.
- Piegare la punta di un ago 18-G a 90 ° 1 cm dalla punta, lato smusso rivolto verso l'alto. Usando una siringa e l'ago calibro 18, posizionare accuratamente 3 mL di soluzione overlay # 1 nel plasma (Tabella 1).
NOTA: L'ago piegato assicura tutte le VLDL / IDL, LDL, HDL e vengono rimossi senza mescolarsi con l'overlay. - Rimuovere la maggior parte delle bolle nella parte superiore, lasciando 2 - 3 mm di spazio dal menisco all'inizio del tubo e carefully posizionare i tubi in secchi SW-40Ti.
- Pesare ciascun segmento (con i tappi) sulla bilancia, ed esattamente l'equilibrio con il secchio opposta (secchio + cap): # 1 a # 4, # 2 alla # 5 e # 3 a # 6.
NOTA: Queste secchi devono essere equilibrati e abbinato a tutti i tempi. - Posizionare il rotore in ultracentrifuge (elenco dei materiali). Centrifugare a 274.400 xg per 24 ore a 4 ° C con un freno intermedio # 4.
- Rimuovere con cautela secchi dal rotore e dei tubi da secchi.
- Rimuovere con cautela 2 mL dallo strato superiore della sovrapposizione con una siringa e l'ago piegato. Questa sarà la frazione VLDL / IDL che può essere conservato a 4 ° C o -80 ° C.
- Dopo aver rimosso la frazione VLDL / IDL, raccogliere il restante 7 ml di campione (plasma) e posizionarlo in un tubo da 15 ml. Portare il volume del campione fino a 9 mL di soluzione overlay # 2 (Tabella 1).
- Regolare la densità del campione da 1.025 g / mL a 1.080 g / mL con KBr utilizzandocirca 0,746 g KBr nel campione 9 mL o 0,0828 g / mL KBr di campione. Agitare delicatamente il campione fino a quando tutto il KBr è sciolto (circa 20 min) e trasferimento in ultracentrifuge tubo mentre bolle garantendo salgono verso l'alto.
- Con siringa e l'ago, posizionare accuratamente 3 mL di soluzione overlay # 3 sul campione (Tabella 1). Lasciare 2 - 3 mm di spazio dal menisco alla sommità del tubo.
- Rimuovere la maggior parte di altri eventuali bolle nella parte superiore del tubo e posizionare accuratamente i tubi ultracentrifuga riempiti in secchi SW-40Ti.
- Pesare ciascun segmento (con i tappi) sulla bilancia, ed esattamente l'equilibrio con il secchio di fronte a + cap, come in 1.1.5.
- Posizionare il rotore in ultracentrifuge (vedi elenco dei materiali). Centrifugare a 274.400 xg per 24 ore a 4 ° C con un freno intermedio # 4.
- Rimuovere con cautela secchi dal rotore e dei tubi da secchi.
- Rimuovere accuratamente 2 mL dallo strato superiore della sovrapposizione con una siringa ed esserent ago. Questa sarà la frazione LDL che può essere conservato a 4 ° C o -80 ° C.
- Dopo aver rimosso la frazione LDL, raccogliere i restanti approssimative 7 ml di campione (plasma) e inserirlo in un nuovo tubo da 15 ml. Portare il volume del campione (plasma) fino a 9 mL con 1.080 g / mL soluzione # 4 (Tabella 1).
- Regolare la densità del campione da 1.080 g / mL a 1,30 g / mL con KBr usando 3,33 g KBr in 9 mL di campione (plasma) o 0,37 g KBr per ogni ml di campione. Rock o leggermente agitare il campione fino a quando tutto il KBr (sale) viene disciolto e trasferimento a ultracentrifuge tubo.
- Con siringa e l'ago, posizionare accuratamente 3 mL di soluzione overlay # 5 sul campione (Tabella 1).
- Rimuovere la maggior parte di altri eventuali bolle nella parte superiore del tubo, lasciando spazio 2- 3 mm dal menisco alla sommità del tubo e posizionare accuratamente i tubi ultracentrifuga riempiti in secchi SW-40Ti.
- Pesare ciascun segmento (con i tappi) sulla bilancia, e precisamente l'equilibrio con il secchio di fronte a + cap, come in 1.1.5.
- Posizionare il rotore in ultracentrifuge (vedi elenco dei materiali). Centrifugare a 274.400 xg per 48 ore a 4 ° C con un freno # 4.
- Rimuovere con cautela secchi dal rotore e dei tubi da secchi.
- Rimuovere con cautela circa 2 ml dallo strato superiore della sovrapposizione con una siringa e l'ago piegato. Questa è la frazione HDL, che può essere conservato a 4 ° C o -80 ° C.
NOTA: A seguito di HDL DGUC può essere dializzato per rimuovere le soluzioni high-sale. - Per dializzare, posizionare la frazione HDL raccolti in un manicotto di dialisi sigillata (10.000 MW cut-off) e dializzare durante la notte in 1 L 1x PBS. buffer di cambiamento di dialisi (1x PBS) per 3 volte nell'arco di 24 ore. perturbazione delicato della PBS con una magnetica mescolare-bar migliorerà la dialisi.
- Determinare la concentrazione proteica del DGUC-HDL utilizzando un metodo BCA 8.
- Fast-proteine liquide Chromatografia (FPLC) o cromatografia di esclusione molecolare (~ 6 h)
- Filter 1.2 mg di DGUC-HDL (proteine totali) in 500 ml attraverso un filtro micron micro-centrifuga 0,22 (vedi elenco dei materiali), immediatamente prima dell'iniezione.
NOTA: Un ulteriore filtraggio del campione DGUC-HDL attraverso un filtro micron micro-centrifuga 0,45 a monte del filtro di 0,22 micron può essere richiesto per alcuni campioni. - Raccogliere il campione DGUC-HDL filtrato, caricare la siringa di iniezione FPLC (riempimento), e assicurarsi che non vi siano bolle nella siringa prima di iniettare nel FPLC.
- Impostare la portata FPLC a 0,3 mL / min con un limite di pressione a 2,6 MPa. Equilibrare le colonne con 0,2 volumi di colonna (circa 15 ml) di tampone, prima di assaggiare l'iniezione. Iniettare il campione con 3 ml di tampone nel (ansa di iniezione) strumento FPLC e iniziare la corsa. Raccogliere 1,5 frazioni ml per un totale di 72 frazioni.
- Filter 1.2 mg di DGUC-HDL (proteine totali) in 500 ml attraverso un filtro micron micro-centrifuga 0,22 (vedi elenco dei materiali), immediatamente prima dell'iniezione.
2. high-throughput Piccolo RNASequencing (sRNAseq, ~ 9 giorni)
- Isolamento RNA (~ 1 giorno)
- Identificare le frazioni FPLC corrispondenti a DGUC-HDL determinando livelli di colesterolo totale utilizzando un kit colorimetrico secondo le istruzioni del produttore. L'utilizzo di questo FPLC set-up, si aspettano di trovare 6 - 7 frazioni FPLC contenenti DGUC-HDL.
- Raccogliere tutto il volume (circa 8 -1 0 mL piscina di 1,45 ml frazione volumi) da frazioni DGUC-HDL FPLC e concentrarsi utilizzando 10 kDa mw unità filtro centrifugo di cut-off a 4.000 xg per 1 ora a 4 ° C o fino HDL concentrato è di circa 100 ml.
- Raccogliere il concentrato HDL e quantificare la concentrazione di proteine totali di HDL utilizzando il metodo BCA 8.
- Determinare la più alta concentrazione di proteine totali HDL, fino a 1 mg, che può essere aliquotati da ciascun campione nella serie. Ad esempio, isolare l'RNA dalla stessa quantità di proteine totali HDL per ogni campione.
- Eseguire Isolamento RNA utilizzandoun protocollo modificato (vedi elenco dei materiali).
- Aggiungere 10x volume di fenolo lisi dei reagenti (vedi elenco dei materiali) del campione e vortex per 1 min.
- Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Aggiungere cloroformio (20% di fenolo lisi volume di reagente utilizzato nella fase 2.1.5.1) e agitare vigorosamente per 15 s.
- Incubare a temperatura ambiente per 2 - 3 min.
- Centrifugare per 15 min a 12.000 xg a 4 ° C in una centrifuga refrigerata.
- Trasferire la fase acquosa superiore in una nuova provetta, evitando l'interfase.
- Aggiungere il volume 1.5x del 100% di etanolo alla fase acquosa e vortex per 1 min.
- Conservare i campioni per almeno 1 ora o durante la notte a -80 ° C.
- Continuare con il protocollo di isolamento di RNA utilizzando il mini colonne fornite.
- Eluire con 30 ml di RNasi-free H 2 O. Prima aggiungere 15 ml di H 2 O direttamente la fritta, rotazione a bassa velocità (2.000 xg) per 2 minuti, epoi girare ad alta velocità (max) per 1 min. Ripetere questa operazione con altri 15 ml di H 2 O.
- procedere immediatamente a sRNA generazione biblioteca o conservare a -80 ° C.
- Generazione Library (~ 6 h)
- Preparare le biblioteche sRNA cDNA utilizzando il protocollo kit sRNA biblioteca generazione, secondo le istruzioni del produttore con una modifica per l'amplificazione PCR, come descritto di seguito.
- Preparare la Mastermix PCR in ghiaccio contenente 0,5 microlitri DNasi / RNasi-free H 2 O, 15 microlitri PCR Mix (PML) e 1 ml di RNA PCR Primer (RP1) per campione (includere un ulteriore 10% per l'errore pipettaggio).
- Aggiungere 16,5 ml di miscela PCR per ciascun campione (cDNA).
- Assegnare un numero di indice / codici a barre per ogni campione per la multiplazione e aggiungere 1 ml PCR Primer Index (al numero corrispondente) per il campione.
- Eseguire un lancio rapido utilizzando il microcentrifuga.
NOTA: Volume totale dovrebbeora essere di 30 microlitri per campione. - Eseguire le condizioni di ciclismo per l'amplificazione PCR si vedano le tabelle 2 e 3.
- Preparare le biblioteche sRNA cDNA utilizzando il protocollo kit sRNA biblioteca generazione, secondo le istruzioni del produttore con una modifica per l'amplificazione PCR, come descritto di seguito.
- Dimensioni Selezionare sRNA Biblioteca Come estrarre l'adattatore: adattatori (~ 1,5 h)
- Eseguire biblioteca size-selezione con il selettore automatico del formato del DNA secondo le istruzioni del produttore con i seguenti parametri di dimensione: Obiettivo: 156 bp, inizio: 135 bp, Fine: 177 bp, Campo Bandiera: Broad.
- DNA Clean Up (~ 0,5 h)
- Pulire dimensione selezionata sRNA cDNA secondo le istruzioni del produttore.
- Eluire pulito e concentrato sRNA cDNA con 2 x 7 microlitri DNasi / RNasi-free H 2 O.
- Quantificare e valutare sRNA cDNA Biblioteca resa e la qualità (~ 1 h)
- Valutare la qualità biblioteca sRNA cDNA e le dimensioni utilizzando un chip di DNA ad alta sensibilità su un Bioanalyzer (elenco dei materiali) secondo manufattole istruzioni del urer.
- Quantificare le singole concentrazioni biblioteca sRNA cDNA usando un test del DNA ad alta sensibilità (Lista dei Materiali), secondo le istruzioni del produttore.
NOTA: Si raccomanda di avere tutti i campioni con differenti indici di essere eseguiti sulla stessa corsia della cella di flusso, se possibile. Se è necessaria più di una corsia, mescolare campioni di casi e di controllo in modo appropriato.
- High-throughput sRNA Sequencing (~ 7 giorni)
- Piscina individuale indicizzato librerie Srna sulla base delle concentrazioni equimolari.
- Schermo pool librerie Srna per qualità utilizzando ad alta sensibilità DNA chip sul Bioanalyzer e determinare la concentrazione di DNA biblioteca come in 2.5.1 - 2.5.2.
- Eseguire la PCR quantitativa (qPCR) di contenuti adattatore per garantire profondità sequenziamento appropriato utilizzando la libreria sequenziamento kit di qPCR quantificazione secondo le istruzioni del produttore (elenco dei materiali).
- Eseguire il sequenziamento utilizzando una sola lettura, 50 bprotocollo p per raggiungere una profondità di circa 20 - 25 M legge / campione, secondo le istruzioni del produttore.
3. Analisi dei dati (~ 1 giorno)
- Utilizzare bcl2fastq2, come da istruzioni manuale d'uso, di pre-elaborazione dei file raw FASTQ di campioni demultiplexati (elenco dei materiali).
- Utilizzare Cutadapt per tagliare adattatori 9 e rimuovere legge <16 nucleotidi (NTS) di lunghezza, come da istruzioni di guida utente (elenco dei materiali).
- Rimuovere le sequenze di contaminazione presenti nelle biblioteche Srna, tra cui la sequenza soluzione di arresto (STP: CCACGTTCCCGTGG) e l'adattatore carry-over (CTACAGTCCGACGATC) utilizzando la funzione removeSequenceInFastq nel quadro NGSPERL, come da istruzioni di guida utente (elenco dei materiali).
- Eseguire metriche di controllo di qualità da parte FastQC utilizzando Center for Quantitative Sciences (CQS) strumenti, come da istruzioni di guida utente (elenco dei materiali).
- Genera elenco non ridondante di "identico", si legge (crollo redundaNT legge) e un numero record di copia utilizzando CQSTools, come da istruzioni di guida utente (elenco dei materiali).
- Allinea legge al genoma umano utilizzando Bowtie1.1.2 permettendo 1 disadattamento (opzioni: -a -m 100 --migliore --strata -v 1), secondo le istruzioni di guida utente (elenco dei materiali).
- Eseguire leggere l'allineamento, il conteggio, e il risultato compiti riepilogo utilizzando NGSPERL, come da istruzioni di guida degli utenti.
- Convertire tavolo conteggio esportati in un foglio di calcolo.
- Normalizzare legge di una specifica classe (ad esempio, miRNA) al numero totale di letture per quella classe (ad esempio, il numero totale di miRNA letture) e segnali di report come Legge Per mappata miRNA (RPMM). (Ad esempio, RPMM = (miR-X / # totale di miRNA letture) * 1.000.000).
- Ingresso normalizzato tabella di numeri come generico tecnologia unico colore nel software per basso livello e differenziali di alto livello analizza come da istruzioni di guida utente (elenco dei materiali).
NOTA: Attualmente, ci sono geni housekeeping non ben caratterizzati / SRNPer quanto riguarda i livelli di HDL-sRNA. Un controllo picco-in può essere utilizzato, ma può essere problematico. Normalizzando HDL ingresso proteine o il volume totale è consigliato. Ancora più importante, si consiglia di convalidare i risultati di sequenziamento da una delle varie strategie per quantificare miRNA e sRNAs formato Real-time PCR o PCR quantitativa.
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Representative Results
Questo protocollo è una serie di metodi consolidati legati insieme per consentire la quantificazione della sRNAs sulla altamente puro HDL by high throughput sequencing o real-time PCR (Figura 1). Per dimostrare la fattibilità e l'impatto di questo protocollo, HDL è stato purificato da plasma umano con il metodo DGUC e FPLC tandem. Raccolti frazioni FPLC corrispondenti a HDL (il colesterolo dalla distribuzione) sono stati concentrati e RNA totale è stato isolato da 1 mg di colesterolo HDL (proteine totali). biblioteche Srna sono stati generati con HDL raccolti da n = 4 soggetti umani sani. Tutti i campioni di sangue / plasma umano sono stati raccolti sotto attiva protocollo Institutional Review Board (# 070.416), e soggetti umani sono stati arruolati con il consenso informato come approvato dalla Vanderbilt University School of Medicine. biblioteche Srna preparati sono stati sequenziati alla Vanderbilt Tecnologie per avanzata genomica (VANTAGE) sono stati eseguiti centro sequenziamento del DNA e analisi dei datiutilizzando tubazioni in-house. visualizzazioni di dati sono stati creati da graficamente software.
La necessità critica di eseguire un secondo metodo (FPLC) per l'isolamento HDL dopo DGUC è a causa di possibili co-purificazione dei veicoli elettrici. I veicoli elettrici sono una classe generalizzata di vescicole di membrana-derivati che provengono da corpi multivesicular (esosomi), membrana plasmatica in erba (microvescicole), e altri processi, tra cui corpi apoptotici 10. EVs, ovvero esosomi, sono stati segnalati per avere una densità simile a piccola HDL (Figura 2A), e quindi, potrebbero essere presenti nella frazione densità HDL (1.063 - 1,21 g / ml) dopo DGUC 11,12. Per rimuovere i veicoli elettrici e altre lipoproteine (ad esempio, LDL), da DGUC-HDL, FPLC è stato utilizzato per HDL separata dalle altre vescicole e particelle di dimensioni; HDL (7 - 12 miglia di diametro) e PA (40 - 220 nm di diametro) sono facilmente frazionati causa delle loro differenze di dimensioni (Figura 2A, B). frazione HDLs erano evidenti a causa della distribuzione di colesterolo e frazioni DGUC-HDL FPLC sono riunite e concentrate utilizzando 10 filtri centrifugazione cut-off kDa. Concentrato HDL sono stati raccolti e utilizzati per l'analisi dell'RNA valle (Figura 2B). Per illustrare questo punto, plasma pre-DGUC stata frazionata mediante FPLC e la distribuzione di fosfolipidi (fosfatidilcolina, PC); colesterolo totale (TC), e livelli di proteina sono stati quantificati e tracciati attraverso le frazioni. PC, TC, e proteine livelli sono stati quantificati con tre kit colorimetrici. Tutti e tre i parametri definiti con chiarezza le frazioni HDL (19 - 24) e frazioni VLDL / LDL (14 - 18). Nel plasma FPLC-frazionata, i segnali di proteine e lipidi sono stati minimamente riconosciuti oppure no rilevati a tutti in frazioni corrispondenti alle vescicole di dimensioni superiori a VLDL (a sinistra della scatola arancione) (Figura 3A). Per dimostrare DGUC separazione delle HDL, DGUC-HDL è stato frazionato anche da FPLC e PC, TC, e livelli di proteine sono state quantifIED (Figura 3B). Tracciando questi valori illustra la co-frazionamento di una piccola quantità di LDL utilizzando DGUC e rinforza la necessità di utilizzare il tandem approccio DGUC-FPLC per isolare HDL altamente puro. Anche se i veicoli elettrici sono previsti per co-frazionare con HDL durante DGUC, c'era poco da nessuno trovato nella lipidi e proteine in frazioni corrispondenti alle vescicole dimensioni maggiori di LDL (Figura 3B). I lipidi EV e la firma proteina nella gamma di dimensione prevista è anche minimamente rilevabile o assente DGUC-VLDL e DGUC-LDL quando frazionata da FPLC (dati non mostrati). Per l'analisi di RNA, l'RNA totale è stato isolato da 1 mg di tandem HDL purificato per sRNA generazione biblioteca. In breve, gli adattatori sono stati ligati al 3 'e poi 5' estremità terminali di sRNAs, tra miRNA e TDR (figura 4a). prodotti legatura sono stati trascrizione inversa (RT) e la PCR amplificati utilizzando primer PCR che ospitano gli indici specifici progettati per i campioni di multiplazione durante Dowreazioni di sequenziamento nstream (Figura 4a). Ogni adattatore è di 61 nti di lunghezza; di conseguenza, un miRNA legatura (circa 22 nti di lunghezza) produrrebbe un prodotto di 144 nti di lunghezza. Molti non miRNA sRNAs sono leggermente più lungo di miRNA (ad esempio, 30 - 35 nti di lunghezza). Come tale, la nostra lunghezza mirata del prodotto era di 156 bps di lunghezza. Prodotti amplificati sono stati utilizzando un selettore automatico del formato del DNA e tutti i prodotti cDNA 135 selezionati size-- sono stati raccolti 177 bps di lunghezza (figura 4a). Le qualità di librerie di dimensioni-selezionati sono stati valutati da chip di DNA ad alta sensibilità utilizzando il bioanalizzatore (Figura 4B). biblioteche sRNA cDNA di queste dimensioni è apparso di dimensioni leggermente maggiori a causa di possibili "spumeggiante" effetti durante l'analisi. Per sequenziamento multiplex concentrazioni equimolari di librerie di cDNA sono state riunite, puliti, concentrati, e rianalizzati usando bioanalizzatore (Figura 4B). Il campione è stato poi multiplex Sequenced utilizzando un unico protocollo di lettura 50 bp. In-house condotte analisi dei dati sono stati usati per demultiplexare campioni basati su indici, tagliare gli adattatori, le metriche di controllo della qualità di esecuzione, si allineano al genoma umano e contano sRNAs annotati. La distribuzione dei normalizzato legge (Legge per milione, RPM),> 16 nti di lunghezza, illustrano l'arricchimento di sRNAs 20 - 22 nti di lunghezza e 34 - 35 nti di lunghezza su HDL (Figura 4C).
Allineamento e analisi conteggio delle quattro librerie di HDL-sRNA scoperto che il 38% delle letture allineamento alle regioni annotazioni del genoma umano erano miRNA (Figura 5A). Allo stesso modo abbondante (37%) erano sRNAs-derivati da tRNA (TDR). sRNAs-RNA derivati da vari (ad esempio, Y RNA), rRNA, smRNAs, snoRNAs, e lunghi RNA non codificanti (lincRNAs) erano presenti anche sul colesterolo HDL (Figura 5A). Dopo la normalizzazione al numero totale di letture per ogni classe, il top 50 più abbondante miRAN (legge Per mappati miRNA, RPMM, figura 5B), TDR (legge Per mappata TDR, RPMT, Figura 5C), e altri non-miRNA non-TDR sRNAs (Legge Per mappata Srna pacchetti RPM, Figura 5D) sono state organizzate da heatmaps . Questi dati illustrano le similitudini (ad esempio, HDL-miRNA) e discrepanze (per esempio, TDR) dei più abbondanti di HDL-sRNAs attraverso soggetti sani (Figura 5B-D). Questi risultati dimostrano la potenza di questa strategia e protocollo di fornire notevoli intuizioni il trasporto di sRNAs da HDL. Tuttavia, sRNA sequenziamento non dovrebbe essere invocata per la quantificazione assoluta. sRNAs di interesse dovrebbero essere convalidati mediante real-time PCR. Allo stesso modo, molti ricercatori possono richiedere solo la quantificazione dei singoli miRNA su HDL. Come tale, totale HDL RNA è stato isolato da ciascun soggetto per la quantificazione relativa di HDL-miRNA mediante real-time PCR. Cinque dei miRNA più abbondanti rilevati sul HDL da sRNAseq sono stati utilizzati per reaPCR l-tempo per determinare i loro livelli su ogni campione HDL (Figura 5E). I valori quantitativi relativi sono stati calcolati utilizzando un servizio di pulizia arbitraria Ct di 32 (RQV = 2 - ΔCtArb) e normalizzati a 1.000 mg di ingresso proteine HDL in isolamento dell'RNA 13. I risultati dello studio PCR in tempo reale dimostrano che questo protocollo è prezioso anche nella rilevazione di HDL-miRNA e quantificare differenze tra gli individui. Collettivamente, gli schemi presentati definiscono i dettagli critici dei metodi e dei risultati di entrambi high-throughput sequencing e real-time PCR approcci rappresentano i risultati finali di questo protocollo.
Figura 1. Rappresentante flow-chart del protocollo. HDL puro è isolato da ultracentrifugazione gradiente di densità e di proteine veloce cromatografia liquida fia. Totale HDL RNA può quindi essere utilizzato per piccoli RNA (sRNA) sequenziamento. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Isolamento di HDL. (A) Diagramma della densità e diametro di lipoproteine e vescicole extracellulari (EV). (B) Schema del sequenziale isolamento tandem HDL, compresa la separazione del plasma, ultracentrifugazione in gradiente di densità (DGUC), fast-proteina cromatografia liquida (FPLC), filtrazione, e la concentrazione. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. Fast-proteina cromatografia liquida (FPLC) Separazione delle lipoproteine EV, vescicole extracellulari.; VLDL, molto lipoproteine a bassa densità; LDL, lipoproteine a bassa densità; HDL, lipoproteine ad alta densità; FP, proteine libero; PC, fosfatidilcolina; e TC, colesterolo totale. Linea rossa, TC; Linea blu, proteine, e la linea nera, PC. La separazione delle lipoproteine da (A) plasma umano prima di ultracentrifugazione in gradiente di densità (DGUC) e (B) frazione HDL dopo DGUC. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. generazione di piccoli RNA biblioteche. (A) Schema di piccoli RNA (sRNA) libreria Construction e la selezione per taglia. miRNA, microRNA; TDR, sRNAs tRNA-derivato; Srna non miRNA non TDR sRNAs; RT, trascrizione inversa; BP, coppia di basi; e cDNA, DNA clonato. (B) Analisi di librerie HDL-Srna, prima e dopo il multiplexing utilizzando chip di DNA ad alta sensibilità e bioanalizzatore. (C) la distribuzione Lunghezza di HDL-sRNA legge dopo il sequenziamento. RPM, Legge per milione; M, soggetti di sesso maschile; F, soggetti di sesso femminile; e nt, nucleotide. N = 4. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. La diversità di HDL-sRNAs. (A) Distribuzione di HDL-sRNAs tra classi di Srna. Frazione di letture allineato con sRNAs annotati nel genoma umano. (BD) Heatmaps n = 4 campioni HDL-Srna.
| 1. Gli antiossidanti per la separazione Lipoprotein | Fai la soluzione di riserva a 100x |
| EDTA | L'acido etilendiamminotetraacetico (0,5 m stock) |
| AZT | 3-Amino-1,2,4-triazolo: 42 mg / mL H 2 O |
| BHT | Butilidrossitoluene: 25 mg / 100 ml EtOH |
| Trolox | (+) - 6-idrossi-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carbossilico: 41,7 mg / 500 ml EtOH |
| 2. Soluzioni Overlay | |
| Soluzione # 1 | 1.019 g / mL in H 2 O |
| Soluzione # 2 | 1.025 g / mL KBr / H 2 O |
| Soluzione # 3 | 1.063 g / mL KBr / H 2 O |
| Soluzione # 4 | 1.080 g / mL KBr / H 2 O |
| Soluzione # 5 | 1.255 g / mL KBr / H 2 O |
| 3. FPLC Buffer | </ Tr> |
| 1 L Ricetta | 50 mL 3M NaCl; 20 mL 0,5 Tris-HCl, pH 7,6; 2 ml di 10% di sodio azide; 930 mL H 2 O |
Tabella 1. Reagenti speciali.
| Palcoscenico | Temp (° C) | Tempo | cicli |
| UN | 98 | 30 s | 1 |
| B | 98 | 10 s | 25 |
| 60 | 30 s | ||
| 72 | 15 s | ||
| C | 72 | 10 minuti | 1 |
Tabella 2.Biblioteca Generazione di amplificazione passaggi.
| Primer | Sequenza |
| Primer 1.1 | AATGATACGGCGACCACCGAGAT |
| Primer 2.1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
Tabella 3. PCR Primer.
| Palcoscenico | Temp (° C) | Tempo | cicli |
| UN | 95 | 10 minuti | 1 |
| B | 95 | 10 s | 40 |
| 60 |
Tabella 4. Biblioteca di quantificazione amplificazione passaggi.
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Discussion
Questo protocollo è stato progettato per quantificare miRNA ed altri sRNAs da high-throughput sequencing o real-time PCR altamente puro HDL. Come con qualsiasi approccio, considerazioni speciali dovrebbero essere dati ad ogni fase del processo di purificazione HDL e RNA e quindi quantificare sRNAs. Questo protocollo è stato progettato per i progetti che iniziano con ≥ 2 ml di plasma. Tuttavia, le analisi di RNA di alta qualità possono essere completati con successo con HDL purificato da un minimo di 80 ml di plasma umano o il mouse utilizzando cromatografia di affinità; tuttavia, i volumi di plasma di partenza più grandi producono dati migliori utilizzando i metodi qui presentati. metodi di lavorazione ed estrazione del campione possono alterare drasticamente la qualità miRNA / sRNA e la resa. L'uso di anticoagulanti, mentre essenziale per la raccolta del plasma, probabilmente influisce estrazione downstream. Ad esempio, l'eparina non viene facilmente rimosso durante l'estrazione dell'RNA 14,15, e può inibire enzimi valle utilizzati in PCR 16-18. Inoltre, there sono rapporti che il citrato di sodio può anche interferire con le misure qPCR dove miRNA da campioni EDTA si dimostri che sono migliorato profilo di espressione rispetto ai campioni citrato di sodio 16,19,20. Questi studi dimostrano la necessità di un'attenta considerazione quando si sceglie un anticoagulante. Inoltre, a causa di un aumento potenziale di lisi cellulare durante la coagulazione, campioni di siero non sono raccomandati come miRNA cellulari lisati possono artificialmente associare con lipoproteine. Allo stesso modo, il plasma è in posizione isolata immediatamente dal sangue intero per evitare la contaminazione da altre cellule del sangue periferico, tra leucociti lisati. Come temperatura fredda è noto per influenzare attivazione piastrinica, campioni di sangue intero vengono filate distanti eritrociti, leucociti e piastrine a 3.000 xg per 15 min a temperatura ambiente. L'emolisi è anche mal consigliato come eritrociti rotti, sono stati segnalati per influenzare anche miRNA esito 21,22, in quanto contengono miRNA che può essere versato durante hemolYsis 23,24. Al plasma può essere conservato a 4 ° C per 2 - 4 settimane, o in alternativa il plasma può essere congelato a -80 ° C in cui i contenuti miRNA è stabile e praticabile sia a breve termine e la conservazione a lungo termine (max 4 anni) 25. A nostra conoscenza attuale, il congelamento campioni di plasma non è previsto per danneggiare HDL-miRNA e campioni di plasma congelati sono adatti per analizzare. Come lipoproteine e altri componenti di sangue intero possono essere influenzate dall'assunzione di cibo, digiuno di raccolta del sangue è preferito.
Come accennato in precedenza, HDL plasma può essere isolato attraverso una serie di metodi standard, tra cui DGUC, FPLC e cromatografia di affinità contro apoA-I. . Isolamento di lipoproteine plasmatiche da DGUC utilizzando KBr, come descritto da Redgraves et al 26, separa VLDL (d = 0.94 - 1.006 g / mL), LDL (d = 1.006 - 1.063 g / mL) e HDL (d = 1,063-1,21 g / mL) ed è un metodo ideale per i grandi volumi di plasma (2 - 60 ml per campione). la limitazionedi utilizzare questo approccio da solo è che esosomi e altri miRNA contenenti veicoli elettrici sono segnalati per avere una densità simile a HDL e possono essere presenti in DGUC HDL (Figura 2A). Altri svantaggi sono possibili danni strutturali alle proteine dall'esposizione di sale nei buffer e le forze ultracentrifugazione forti così come stabilità differenziali di HDL sottoclassi 27,28. Nonostante questo, DGUC è comunemente usato come risulta in una elevata resa di proteine HDL, producendo vicino a 1 mg di proteine HDL per 1 ml di plasma 29. L'approccio FPLC, che comporta esclusione dimensionale gel filtrazione, richiede meno tempo, a seconda della portata (circa 6 ore), ed ha una maggiore precisione separa HDL da apoB-contenenti lipoproteins (per dimensione) e loro sottoclassi, compresi EVs che sono molto più grandi di HDL, ma hanno densità simile. Va osservato che utilizzando i metodi descritti in questo protocollo, vescicole plasma tra circa 220 - 75 Nm in diametro non dosuscitare una lipidi o di proteine firma rilevabile quando separati da FPLC. A seconda del set-up, FPLC richiede relativamente piccolo ingresso 0,3 - 1 mL, che è utile per il plasma roditori e piccole aliquote congelate. test colorimetrici colesterolo rapidi sono importanti anche a seguito FPLC per confermare la distribuzione di HDL o altre frazioni lipoproteine. Frazionamento diluisce campioni e lipoproteine; tuttavia, i campioni possono quindi essere concentrati usando size-filtri centrifughe standard (ad es, 10 kDa Mw di taglio del filtro). isolamento HDL apoA-IP utilizzando le colonne di micro-rotazione sono il più veloce dei tre approcci, ma sono limitati dal basso input (0,08-1 ml) il volume e bassa resa (circa 0,1 mg). Mentre apoA-I IP può essere laborioso, questo metodo è ideale per basso volume surnatanti di colture cellulari. Mentre ciascuno di questi metodi ha punti di forza e di debolezza, questi possono essere ridotti se usato in tandem (ad esempio, DGUC seguita FPLC). Utilizzando due approcci in tandem, i risultati in una maggiore purezzaHDL per miRNA e sRNA analisi.
Qui, abbiamo dettagliato i passaggi necessari per isolare HDL altamente puro con il metodo tandem di DGUC seguito da FPLC e delineato i passi utilizzati per quantificare HDL-miRNA e sRNAs utilizzando sequenziamento high-throughput o real-time PCR. Anche se questo protocollo è stato progettato per HDL, ha grande applicabilità per quantificare sRNAs su altri lipoproteine, tra LDL e VLDL, in base alle loro densità e dimensioni.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45 µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
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