Abstract
La diversidad de pequeños ARN no codificantes (sRNA) se está expandiendo rápidamente y están surgiendo sus papeles en los procesos biológicos, incluyendo la regulación de genes,. Lo más interesante es sRNAs también se encuentran fuera de las células y se presente de forma estable en todos los fluidos biológicos. Como tal, sRNAs extracelulares representan una nueva clase de biomarcadores de la enfermedad y es probable que participan en la señalización celular y las redes de comunicación intercelulares. Para evaluar su potencial como biomarcadores, sRNAs pueden ser cuantificados en plasma, orina y otros fluidos. Sin embargo, para entender completamente el impacto de sRNAs extracelulares como señales endocrinas, es importante para determinar qué compañías están transportando y protegerlos en fluidos biológicos (por ejemplo, plasma), que las células y los tejidos contribuyen a piscinas sRNA extracelulares, y las células y los tejidos capaces de aceptar y utilizar extracelular sRNA. Para lograr estos objetivos, es fundamental para aislar poblaciones altamente puros de portadores extracelularespara sRNA de perfiles y la cuantificación. Hemos demostrado anteriormente que las lipoproteínas, en particular de las lipoproteínas de alta densidad (HDL), el transporte microARN (miARN) funcionales entre las células y el HDL-miRNAs son significativamente alteradas en la enfermedad. A continuación, detallamos un nuevo protocolo que utiliza tándem aislamiento HDL con ultracentrifugación en gradiente de densidad (DGUC) y rápido-proteína-cromatografía líquida (FPLC) para obtener HDL de alta pureza para el perfilado de aguas abajo y cuantificación de todos los sRNAs, incluyendo miRNAs, utilizando tanto alta secuenciación -throughput y enfoques de PCR en tiempo real. Este protocolo será un recurso valioso para la investigación de sRNAs sobre el HDL.
Introduction
No codificante ARN pequeños extracelulares (sRNAs) representan una nueva clase de biomarcadores de la enfermedad y las posibles dianas terapéuticas y es probable que facilitan la comunicación de célula a célula 1. El tipo más ampliamente estudiada de sRNA son los microARN (miARN) que son aproximadamente 22 nts de longitud y se procesan a partir de formas precursoras más largas y transcritos primarios 2. miRNAs se han demostrado a la post-transcriptionally regular la expresión génica a través de la supresión de la traducción de la proteína y la inducción de la degradación del ARNm 2. Sin embargo, los miRNAs son sólo uno de los muchos tipos de sRNAs; como sRNAs pueden escindirse de ARNt padres (sRNAs tRNA derivados, TDR), pequeños ARN nucleares (sRNAs derivados sRNA, sndRNA), pequeños RNAs nucleolar (sRNAs derivados de ARNsno, snRNA), ARN ribosomal (sRNAs, RDR rRNA derivados ), y ARN (YDR), y otros ARN diverso 1. Unos pocos ejemplos de estos nuevos sRNAs se ha informado de función similar a miRNAs; sin embargo, el fu biológicanctions de muchos de estos sRNAs que queda por determinar, aunque funciones en la regulación de genes es probable 3-6. Lo más interesante, miRNAs y otros sRNAs son presente de forma estable en los fluidos extracelulares, incluyendo la saliva, plasma, orina y bilis. sRNAs extracelulares se probable protegidos de RNasas través de su asociación con vesículas extracelulares (EV), lipoproteínas, y / o complejos de ribonucleoproteínas extracelulares.
Anteriormente, se informó de que las lipoproteínas, a saber, las lipoproteínas de alta densidad (HDL), miRNAs de transporte en el plasma 7. En este estudio, HDL se aisló utilizando un método secuencial de la ultracentrifugación en gradiente de densidad (DGUC), cromatografía líquida de proteína rápida (de exclusión por tamaño de filtración en gel cromatografía, FPLC), y cromatografía de afinidad (anti-apolipoproteína AI (apoA-I) inmunoprecipitación ) 7. Con las dos matrices en tiempo real de baja densidad basados en PCR y ensayos de miARN individuales, los niveles de miARN se cuantificaron sobre el HDL aisladas de curartu y 7 sujetos hipercolesterolémicos. Con este enfoque, hemos sido capaces de perfil miRNAs y cuantificar miRNAs específicos en las preparaciones de HDL de alta pureza. Desde 2011, se ha determinado que a pesar de cromatografía de afinidad mejora la pureza del HDL, la saturación de anticuerpos limita en gran medida el rendimiento, y puede ser un costo prohibitivo. Actualmente, el protocolo recomienda un método tándem secuencial de dos etapas de DGUC seguido de FPLC, que también produce muestras de HDL de alta calidad para aguas abajo aislamiento de ARN y cuantificación sRNA. Debido a los recientes avances en la secuenciación de alto rendimiento de sRNAs (sRNAseq), por ejemplo, los miRNAs, y el aumento de la conciencia de otras clases no miARN sRNA, sRNAseq es el estado actual de la técnica en el miARN y sRNA perfiles. Como tal, nuestro protocolo recomienda que cuantifican miRNAs y otros sRNAs en muestras de HDL utilizando sRNAseq. No obstante, el ARN total aislado de HDL también se puede utilizar para cuantificar miRNAs individuales y otros sRNAs o validar los resultados sRNAseq usando PCR en tiempo real unapproaches. A continuación se describe en detalle un protocolo para la extracción, purificación, cuantificación, análisis de datos y validación de alta pureza HDL-sRNAs.
El objetivo general de este trabajo es demostrar la viabilidad y el proceso de cuantificación en sRNA HDL altamente puro aislado del plasma humano.
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Protocol
1. Purificación HDL (~ 5,5 días)
- La ultracentrifugación en gradiente de densidad (DGUC, ~ 5 días)
- Añadir 90 l de 100x antioxidantes para 9 ml de plasma aisladas de sangre venosa fresca.
- Ajuste la densidad de plasma con KBr de 1,006 g / ml a 1,025 g / ml mediante la adición de 0,251 g de KBr a 9 ml de plasma de la Etapa 1.1.1 (0,0278 g / ml de plasma KBr). Rock the plasma hasta que toda la sal se disuelve a temperatura ambiente y transferir ultracentrifugar tubos y asegurar que todas las burbujas suben a la superficie.
- Doble la punta de una aguja de 18 G a 90 ° 1 cm de la punta, con el lado cónico hacia arriba. El uso de una jeringa y la aguja de calibre 18, se coloca cuidadosamente 3 ml de solución de recubrimiento # 1 sobre el plasma (Tabla 1).
NOTA: La aguja doblada asegura toda la VLDL / IDL, LDL y HDL se eliminan sin mezclarse con la superposición. - Eliminar la mayoría de las burbujas en la parte superior, dejando 2 - espacio 3 mm del menisco en la parte superior del tubo y carefuLLY colocar los tubos en cubos SW-40Ti.
- Pesar cada cubeta (con las tapas) en el equilibrio, y equilibrar exactamente con el cubo opuesto (cubo + cap): # 1 a # 4, # 2 y # 5 y # 3 a # 6.
NOTA: Estos cubos deben ser equilibrados y emparejado en todo momento. - Coloque el rotor en ultracentrífuga (Lista de Materiales). Centrifugar a 274.400 xg durante 24 horas a 4 ° C con un freno intermedio # 4.
- Retirar con cuidado cubos de rotor y los tubos de los cubos.
- Retire cuidadosamente 2 ml de la capa superior de la superposición usando una jeringa y una aguja doblada. Esta será la fracción VLDL / IDL que puede ser almacenado en 4 ° C o -80 DO.
- Después de la eliminación de la fracción VLDL / IDL, recoger el restante 7 ml de muestra (plasma) y colocarlo en un tubo cónico de 15 ml. Llevar el volumen de la muestra hasta 9 ml con solución de recubrimiento # 2 (Tabla 1).
- Ajustar la densidad de la muestra de 1,025 g / ml a 1,080 g / ml con KBr usandoaproximadamente 0,746 g de KBr en la muestra 9 ml o 0,0828 g / ml de KBr muestra. Agite suavemente la muestra hasta que todo el KBr se disuelve (aproximadamente 20 minutos) y transferir ultracentrifugar tubo mientras burbujas asegurando suben a la superficie.
- Con jeringa y aguja, coloque cuidadosamente 3 ml de solución de superposición # 3 sobre la muestra (Tabla 1). Deja 2-3 mm espacio de menisco en la parte superior del tubo.
- Retire la mayoría de las burbujas restantes en la parte superior del tubo y se coloca cuidadosamente los tubos de ultracentrífuga y dolorosas en los cubos SW-40Ti.
- Pesar cada cubeta (con las tapas) en el equilibrio, y equilibrar exactamente con el cubo opuesto + cap, como en 1.1.5.
- Coloque el rotor en ultracentrífuga (ver Lista de Materiales). Centrifugar a 274.400 xg durante 24 horas a 4 ° C con un freno intermedio # 4.
- Retirar con cuidado cubos de rotor y los tubos de los cubos.
- Retire cuidadosamente 2 ml de la capa superior de la superposición usando una jeringa y sernt aguja. Esta será la fracción LDL que puede ser almacenado en 4 ° C o -80 DO.
- Después de la eliminación de la fracción LDL, recoger los restantes aproximadas 7 ml de muestra (plasma) y colocarlo en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Llevar el volumen de la muestra (plasma) hasta 9 ml con 1,080 g / ml solución # 4 (Tabla 1).
- Ajustar la densidad de la muestra de 1,080 g / ml a 1,30 g / ml con KBr usando 3,33 g de KBr en el 9 ml de muestra (plasma) o 0,37 g de KBr por cada ml de muestra. Roca o agitar ligeramente la muestra hasta que todo se disuelva el KBr (sal) y transferir ultracentrifugar tubo.
- Con jeringa y aguja, coloque cuidadosamente 3 ml de solución de superposición # 5 sobre la muestra (Tabla 1).
- Eliminar la mayoría de las burbujas restantes en la parte superior del tubo, dejando espacio 2- 3 mm del menisco en la parte superior del tubo y se coloca cuidadosamente los tubos de ultracentrífuga llenos en cubos SW-40Ti.
- Pesar cada cubeta (con los tapones) en el equilibrio, y exactamente el equilibrio con el cubo opuesto + cap, como en 1.1.5.
- Coloque el rotor en ultracentrífuga (ver Lista de Materiales). Centrifugar a 274.400 xg durante 48 horas a 4 ° C con un freno de # 4.
- Retirar con cuidado cubos de rotor y los tubos de los cubos.
- Retirar con cuidado aproximadamente 2 ml de la capa superior de la superposición usando una jeringa y una aguja doblada. Esta es la fracción de HDL, que se puede almacenar a 4 ° C o -80 ° C.
NOTA: Después de HDL DGUC puede ser dializada para eliminar las soluciones de alto contenido de sal. - Para diálisis, coloque la fracción HDL recogido en una funda de diálisis sellado (10.000 MW de corte) y se dializa durante la noche en 1 L de 1x PBS. tampón de Cambio de diálisis (1x PBS) 3 veces más de 24 h. perturbación suave de la PBS con una varilla de agitación magnética mejorará la diálisis.
- Determinar la concentración de proteína de la DGUC-HDL usando un método BCA 8.
- Fast Protein Liquid Croncromatografía (FPLC) o de exclusión por tamaño cromatografía (~ 6 h)
- Filtro de 1,2 mg de DGUC-HDL (proteína total) en 500 l a través de un filtro de micras micro-centrífuga 0,22 (véase la lista de Materiales), inmediatamente antes de la inyección.
NOTA: Un filtrado adicional de la muestra DGUC-HDL a través de un filtro de 0,45 micras micro-centrífuga antes del filtro de 0,22 micras puede ser necesario para algunas muestras. - Recoger la muestra filtrada DGUC-HDL, cargar la jeringa de inyección de FPLC (relleno), y asegurarse de que no haya burbujas en la jeringa antes de la inyección en el FPLC.
- Ajuste el caudal de FPLC a 0,3 ml / min con un límite de presión a 2,6 MPa. Equilibrar columnas con 0,2 volúmenes de columna (aproximadamente 15 ml) de tampón, antes de la inyección de la muestra. Se inyecta la muestra con 3 ml de tampón en el instrumento de FPLC (circuito de inyección) y empezar la carrera. Recoger fracciones de 1,5 ml para un total de 72 fracciones.
- Filtro de 1,2 mg de DGUC-HDL (proteína total) en 500 l a través de un filtro de micras micro-centrífuga 0,22 (véase la lista de Materiales), inmediatamente antes de la inyección.
2. De alto rendimiento Pequeño ARNSecuenciación (sRNAseq, ~ 9 días)
- Aislamiento de ARN (~ 1 día)
- Identificar las fracciones de FPLC correspondientes a DGUC-HDL mediante la determinación de los niveles de colesterol total usando un kit colorimétrico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El uso de este FPLC puesta a punto, espera encontrar 6 - 7 fracciones FPLC contienen DGUC-HDL.
- Recoger todo el volumen (aproximadamente 8 mL -1 0 piscina de 1,45 ml fracción volúmenes) de las fracciones HDL-DGUC FPLC y concentrar utilizando 10 kDa mw unidades centrífugas filtro de corte a 4.000 xg durante 1 hora a 4 ° C o hasta que el concentrado de HDL es de aproximadamente 100 l.
- Se recoge el concentrado de HDL y cuantificar la concentración de proteína total HDL mediante el método BCA 8.
- Determinar la concentración más alta de proteína total HDL, hasta 1 mg, que se pueden dividió en partes alícuotas de cada muestra en el conjunto. Por ejemplo, aislar ARN a partir de la misma cantidad de proteína total HDL para cada muestra.
- Realizar Aislamiento de ARN usandoun protocolo modificado (véase la lista de materiales).
- Añadir 10 volúmenes de reactivo de fenol lisis (ver Lista de Materiales) de la muestra y agitar durante 1 min.
- Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Añadir cloroformo (20% del volumen de reactivo de fenol lisis utilizado en el paso 2.1.5.1) y agitar vigorosamente durante 15 s.
- Incubar a temperatura ambiente durante 2 - 3 min.
- Centrifugar durante 15 min a 12.000 xg a 4 ° C en una centrífuga refrigerada.
- Transferir la fase acuosa superior a un nuevo tubo, evitando la interfase.
- Añadir un volumen 1,5 veces de 100% de etanol a la fase acuosa y agitar durante 1 min.
- Almacenar las muestras durante al menos 1 hora o durante la noche a -80 ° C.
- Continuar con el protocolo de aislamiento de ARN usando el mini columnas previstas.
- Eluir con 30 l de H RNasa libre de 2 O. En primer lugar añadir 15 l de H2O directamente a la frita, giro a baja velocidad (2.000 x g) durante 2 minutos, ya continuación, girar a alta velocidad (max) durante 1 minuto. Repita este paso con un 15 l adicionales de H 2 O.
- Inmediatamente proceder a sRNA la generación de bibliotecas o almacenar a -80 ° C.
- Generación de biblioteca (~ 6 h)
- Preparar bibliotecas sRNA cDNA utilizando el protocolo del kit sRNA biblioteca generación, según las instrucciones del fabricante con una modificación de la amplificación por PCR como se detalla a continuación.
- Preparar la mezcla maestra de PCR en hielo que contiene H 0,5 l de DNasa / RNasa libre de O 2, 15 l de PCR Mix (LMP) y 1 l de RNA PCR Primer (RP1) por muestra (incluya un 10% adicional para el error pipeteo).
- Añadir 16,5 l de la mezcla de PCR a cada muestra (ADNc).
- Asignar un número de índice / código de barras para cada muestra para la multiplexación y añadir 1 Índice de cebador de PCR l (con el número correspondiente) a la muestra.
- Realizar una vuelta rápida utilizando la microfuga.
NOTA: El volumen total debeahora ser de 30 l por muestra. - Realizar las condiciones de los ciclos para la amplificación por PCR como se detalla en las tablas 2 y 3.
- Preparar bibliotecas sRNA cDNA utilizando el protocolo del kit sRNA biblioteca generación, según las instrucciones del fabricante con una modificación de la amplificación por PCR como se detalla a continuación.
- Seleccione el tamaño sRNA Biblioteca a retirar el adaptador: Adaptadores (~ 1,5 h)
- Realizar la selección de tallas de la biblioteca usando el selector automático de tamaño de ADN según las instrucciones del fabricante con los siguientes parámetros de tamaño: Objetivo: 156 pb, de inicio: 135 pb, Fin: 177 pb, Bandera Rango: Amplio.
- DNA Clean Up (~ 0,5 h)
- Limpiar tamaño seleccionado sRNA cDNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Eluir limpia y se concentró sRNA ADNc con H 2 x 7 l DNasa / RNasa libre de 2 O.
- Cuantificación y evaluación de sRNA cDNA Biblioteca rendimiento y calidad (~ 1 h)
- Evaluar la calidad de la biblioteca de ADNc sRNA y tamaño usando un chip de ADN de alta sensibilidad en un Bioanalyzer (Lista de Materiales) según manufactinstrucciones del urer.
- Cuantificar las concentraciones individuales de la biblioteca de ADNc sRNA usando un ensayo de ADN de alta sensibilidad (Lista de Materiales), según las instrucciones del fabricante.
NOTA: Se recomienda disponer de todas las muestras con diferentes índices que se ejecuten en el mismo carril de la celda de flujo, si es posible. Si se requiere más de un carril, mezclar muestras de casos y de control apropiada.
- De alto rendimiento de secuenciación sRNA (~ 7 días)
- Piscina individuo indexado bibliotecas sRNA en base a concentraciones equimolares.
- Pantalla agruparon bibliotecas sRNA de calidad mediante chip de ADN de alta sensibilidad en el Bioanalyzer y determinar la concentración de ADN de la biblioteca como en 2.5.1 - 2.5.2.
- Realizar PCR cuantitativa (qPCR) del contenido adaptador para asegurar la profundidad adecuada secuenciación utilizando la biblioteca de secuenciación kit de cuantificación qPCR según las instrucciones del fabricante (Lista de Materiales).
- Realizar la secuenciación utilizando una sola lectura, 50 bprotocolo de p para llegar a una profundidad de aproximadamente 20-25 M lee / muestra, según las instrucciones del fabricante.
3. Análisis de Datos (~ 1 día)
- Utilice bcl2fastq2, según las instrucciones Guía del usuario, a los archivos FASTQ prima procesamiento previo de muestras desmultiplexadas (Lista de Materiales).
- Utilice Cutadapt para recortar adaptadores 9 y retire lee <16 nucleótidos (NTS) de longitud, siguiendo las instrucciones del manual de usuario (Lista de Materiales).
- Eliminar las secuencias de contaminación presentes en las bibliotecas, incluyendo sRNA secuencia de solución de parada (STP: CCACGTTCCCGTGG) y adaptador de arrastre (CTACAGTCCGACGATC) utilizando la función removeSequenceInFastq en marco NGSPERL, según instrucciones de la guía del usuario (Lista de Materiales).
- Realizar mediciones de control de calidad mediante el uso de FastQC Centro de Ciencias Cuantitativas (SCC) herramientas, según instrucciones de la guía del usuario (Lista de Materiales).
- Generar lista no redundante de "idéntico", se lee (redunda colapsont lee) y el número de copias de registros mediante CQSTools, según instrucciones de la guía del usuario (Lista de Materiales).
- Align lee al genoma humano utilizando Bowtie1.1.2 permitiendo 1 desajuste (opciones: -a -m 100 --el mejor --strata -v 1), según las instrucciones del manual de usuario (Lista de Materiales).
- Realice la alineación leer, contar y dar lugar a tareas de resumen utilizando NGSPERL, según instrucciones de la guía de usuario.
- Convertir tabla de recuento exportado a un archivo de hoja de cálculo.
- Normalizar lee de una clase específica (por ejemplo, los miRNAs) con el número total de lecturas para esa clase (por ejemplo, el número total de miRNAs lecturas) y las señales del informe como Lee miARN Por asignada (RPMM). (Por ejemplo, RPMM = (miR-X / # total de miARN lecturas) * 1.000.000).
- Entrada normalizado tabla de conteo como la tecnología de un solo color genérico en el software de bajo nivel y diferenciado de alto nivel de análisis según instrucciones de la guía del usuario (Lista de Materiales).
NOTA: En la actualidad, existen genes de limpieza no bien caracterizados / SRNEn cuanto a HDL-sRNA. Un control de espiga-in puede ser utilizado, pero puede ser problemático. La normalización de la proteína de entrada a HDL o el volumen total se aconseja. Lo más importante, se recomienda para validar los resultados de secuenciación por una de las diversas estrategias para cuantificar miRNAs y sRNAs utilizando PCR en tiempo real o PCR cuantitativa.
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Representative Results
Este protocolo es una serie de métodos establecidos unidos entre sí para permitir la cuantificación de sRNAs en HDL altamente puro mediante secuenciación de alto rendimiento o en tiempo real PCR (Figura 1). Para demostrar la viabilidad y el impacto de este protocolo, el HDL se purificó a partir de plasma humano por el método DGUC y FPLC tándem. Las fracciones recogidas correspondientes a FPLC HDL (por la distribución de colesterol) se concentraron y el ARN total fue aislado de 1 mg de HDL (proteína total). bibliotecas sRNA se generaron con HDL recogido de n = 4 sujetos humanos sanos. Todas las muestras de sangre / plasma humanos fueron recogidos bajo el protocolo activo Junta de Revisión Institucional (# 070416), y los sujetos humanos se inscribieron con el consentimiento informado aprobado por la Facultad de Medicina de la Universidad de Vanderbilt. sRNA bibliotecas preparadas fueron secuenciados en Vanderbilt Tecnologías de Avanzada Genómica (AVANZADO) se realizaron Centro de Secuenciación del ADN y análisis de datosel uso de gasoductos internos. visualizaciones de datos fueron creados mediante la representación gráfica de software.
La necesidad crítica para llevar a cabo un segundo método (FPLC) para el aislamiento de HDL después DGUC es debido a la posible co-purificación de los vehículos eléctricos. Los vehículos eléctricos son una clase generalizada de vesículas de membrana derivadas que se originan a partir de cuerpos multivesiculares (exosomas), membrana plasmática en ciernes (microvesículas), y otros procesos, incluyendo cuerpos apoptóticos 10. Vehículos eléctricos, a saber exosomas, se ha informado que tienen una densidad similar a la pequeña HDL (Figura 2A), y por lo tanto, podrían estar presentes en la fracción de densidad HDL (1,063 a 1,21 g / ml) después de DGUC 11,12. Para retirar los vehículos eléctricos y otras lipoproteínas (por ejemplo, LDL), a partir de DGUC-HDL, FPLC se utilizó para HDL separada de otras vesículas y partículas por tamaño; HDL Solo (7 - 12 nm de diámetro) y vehículos eléctricos (40 - 220 nm de diámetro) se fraccionan con facilidad debido a sus diferencias de tamaño (Figura 2A, B). fracción HDLs eran evidentes debido a la distribución de colesterol, y se combinaron las fracciones HDL-DGUC FPLC y se concentraron usando filtros de centrifugación de 10 kDa de corte. Concentrada HDL se recogieron y se utiliza para el análisis de ARN de aguas abajo (Figura 2B). Para ilustrar este punto, plasma pre-DGUC fue fraccionado utilizando FPLC y la distribución de fosfolípidos (fosfatidilcolina, PC); colesterol total (TC), y los niveles de proteína se cuantificaron y se representaron gráficamente a través de fracciones. PC, TC, y proteínas niveles se cuantificaron utilizando tres kits colorimétricos. Los tres parámetros definen claramente las fracciones de HDL (19 - 24) y las fracciones VLDL / LDL (14 - 18). En el plasma fraccionado-FPLC, las señales de proteínas y lípidos se detectaron mínimamente o no detectados en absoluto en las fracciones correspondientes a los tamaños de vesículas mayor que VLDL (a la izquierda de la caja de naranja) (Figura 3A). Para demostrar la separación DGUC de HDL, DGUC-HDL también se fraccionó por FPLC y PC, TC, y los niveles de proteínas se quantifIED (Figura 3B). Trazado de estos valores ilustra la co-fraccionamiento de una pequeña cantidad de LDL usando DGUC y refuerza la necesidad de utilizar el tándem enfoque DGUC-FPLC para aislar HDL altamente puro. Aunque los vehículos eléctricos se prevé que co-fraccionar con HDL durante DGUC, había poco que ninguno se encuentra en los lípidos y proteínas en las fracciones correspondientes a la vesícula tamaños mayores de LDL (Figura 3B). El lípido EV y la firma de proteínas en el intervalo de tamaño predicho también es mínimamente detectable o ausente de DGUC-VLDL y LDL-DGUC cuando se fracciona por FPLC (datos no mostrados). Para el análisis de ARN, el ARN total fue aislado de 1 mg de HDL purificada tándem para sRNA la generación de bibliotecas. Brevemente, se ligaron adaptadores a la 3 'y luego 5' extremos terminales de sRNAs, incluyendo miRNAs y TDR (Figura 4A). productos ligados se transcripción inversa (RT) y PCR amplificados usando cebadores de PCR que albergan índices específicos diseñados para las muestras de multiplexación durante dowreacciones de secuenciación nstream (Figura 4A). Cada adaptador es de 61 nts de longitud; Por lo tanto, un miARN ligado (aproximadamente 22 nts de longitud) produciría un producto de 144 nts de longitud. Muchos no-miARN sRNAs son ligeramente más largos que los miRNAs (por ejemplo, 30 - 35 nts de longitud). Como tal, nuestra longitud específica del producto fue de 156 bps de longitud. Los productos amplificados fueron el uso de un selector de tamaño automático de ADN y todos los productos de ADNc 135 seleccionado por tamaño - se recogieron 177 bps de longitud (Figura 4A). Las cualidades de las bibliotecas de tamaño seleccionado se evaluaron mediante chips de ADN de alta sensibilidad utilizando el Bioanalyzer (Figura 4B). bibliotecas de ADNc sRNA de este tamaño parecían ligeramente más grande en tamaño debido a la posible "burbujeo" efectos durante el análisis. Para la secuenciación multiplexada, las concentraciones equimolares de bibliotecas de cDNA se agruparon, se limpian, se concentraron y se volvieron a analizar usando el Bioanalyzer (Figura 4B). Después, la muestra se multiplexado Sequenced utilizando un único protocolo de lectura de 50 pb. Dentro de la casa se utilizan tuberías de análisis de datos para demultiplexar muestras basadas en índices, recortar los adaptadores, las métricas de control de calidad de ejecución, se alinean con el genoma humano y contar sRNAs anotado. La distribución de las normalizada lecturas (lecturas por millón, RPM),> 16 nts de longitud, ilustran el enriquecimiento de sRNAs 20 - 22 nts de longitud y 34 - 35 nts de longitud sobre el HDL (Figura 4C).
La alineación y el análisis de conteo de las cuatro bibliotecas de HDL-sRNA encontraron que el 38% de las lecturas de la alineación de las regiones con anotaciones del genoma humano fueron miRNAs (Figura 5A). Igualmente abundantes (37%) fueron sRNAs-derivados de ARNt (TDR). sRNAs-ARNs derivados de diversos (por ejemplo, Y ARN), rRNAs, smRNAs, snoRNAs, y largos ARNs no codificantes (lincRNAs) también estuvieron presentes en el HDL (Figura 5A). Después de la normalización con el número total de lecturas para cada clase, la parte superior 50 más abundante MIRAN (lecturas por asignar unidades miARN, RPMM, Figura 5B), los TDR (lecturas por asignada TDR RPMT, Figura 5C), y otros no-miARN no TDR sRNAs (lecturas por asignada sRNA, RPMS, Figura 5D) fueron organizados por heatmaps . Estos datos ilustran las similitudes (por ejemplo, HDL-miRNAs) y discrepancias (por ejemplo, TDR) de los más abundantes de HDL-sRNAs a través de sujetos sanos (Figura 5B-D). Estos resultados demuestran el poder de esta estrategia y el protocolo para proporcionar sorprendentes detalles sobre el transporte de sRNAs por HDL. Sin embargo, la secuenciación sRNA no debe ser invocado para la cuantificación absoluta. sRNAs de interés deben ser validados por PCR en tiempo real. Del mismo modo, muchos investigadores pueden requerir solamente la cuantificación de miRNAs individuales en HDL. Como tal, el total de RNA se aisló HDL de cada sujeto para la cuantificación relativa de HDL-miRNAs utilizando PCR en tiempo real. Cinco de los miRNAs más abundantes detectados en el HDL en sRNAseq fueron utilizados para reaPCR en tiempo l para determinar sus niveles de HDL cada muestra (Figura 5E). Los valores cuantitativos relativos se calcularon utilizando un servicio de limpieza arbitrario Ct de 32 (RQV = 2 - ΔCtArb) y normalizado a 1 000 g de proteína de entrada HDL en el aislamiento de ARN 13. Los resultados del estudio en tiempo real PCR demuestran que este protocolo también es valioso en la detección de HDL-miRNAs y cuantificar las diferencias entre los individuos. En conjunto, los esquemas presentados definen los detalles críticos de los métodos y los resultados de ambos secuenciación de alto rendimiento y en tiempo real PCR enfoques representan los resultados de este protocolo.
Figura 1. Diagrama de flujo Representante del Protocolo. HDL puro se aisló a partir de la ultracentrifugación en gradiente de densidad y Chromatog líquida rápida de proteínas grafía. ARN total HDL puede entonces ser utilizada para los pequeños ARN de secuenciación (sRNA). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Aislamiento de HDL. (A) Gráfico de la densidad y el diámetro de las lipoproteínas y vesículas extracelulares (EV). (B) Esquema de aislamiento secuencial tándem HDL, incluyendo la separación de plasma, ultracentrifugación en gradiente de densidad (DGUC), rápido de proteínas cromatografía líquida (FPLC), filtración y concentración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. Fast-proteína cromatografía líquida (FPLC) Separación de las lipoproteínas EV, vesículas extracelulares.; VLDL, lipoproteínas de muy baja densidad; LDL, lipoproteínas de baja densidad; HDL, lipoproteínas de alta densidad; FP, proteína libre; PC, fosfatidilcolina; y el TC, el colesterol total. línea roja, TC; línea azul, la proteína, y la línea de Negro, PC. La separación de las lipoproteínas de (A) plasma humano antes de la ultracentrifugación en gradiente de densidad (DGUC) y (B) fracción de HDL después DGUC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Generación de los pequeños ARN Bibliotecas. (A) Esquema de pequeños ARN (sRNA) c bibliotecaonstrucción y la selección de tallas. miARN, microARN; TDR, sRNAs ARNt-deriva; sRNA, no miARN no TDR sRNAs; RT, la transcripción inversa; pb, pares de bases; y ADNc, ADN clonado. (B) Análisis de las bibliotecas de HDL-sRNA antes y después de la multiplexación mediante chips de ADN de alta sensibilidad y Bioanalyzer. (C) Distribución de la longitud de HDL-sRNA lee después de la secuenciación. RPM, lee por millón; M, sujetos de sexo masculino; F, sujetos femeninos; y nt, nucleótido. N = 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Diversidad de HDL-sRNAs. (A) Distribución de HDL-sRNAs en todas las clases sRNA. Fracción de lecturas alineado con sRNAs anotado en el genoma humano. (BD) Heatmaps n = 4 muestras de HDL-sRNA.
| 1. Antioxidantes para la separación de lipoproteínas | Hacer solución madre a 100x |
| EDTA | ácido etilendiaminotetraacético (0,5 m stock) |
| AZT | 3-amino-1,2,4-triazol: 42 mg / mL H 2 O |
| BHT | Hidroxitolueno butilado: 25 mg / 100 l EtOH |
| TROLOX | (+) - 6-hidroxi-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxílico: 41,7 mg / 500 l EtOH |
| 2. Soluciones de superposición | |
| Solución # 1 | 1,019 g / ml en H2O |
| Solución # 2 | 1,025 g / ml de KBr / H2O |
| Solución # 3 | 1,063 g / ml de KBr / H2O |
| Solución # 4 | 1,080 g / ml de KBr / H2O |
| Solución # 5 | 1.255 g / ml de KBr / H2O |
| 3. FPLC Buffer | </ Tr> |
| 1 L Receta | 50 ml de NaCl 3M; 20 ml 0,5 Tris-HCl, pH 7,6; 2 ml de 10% de azida de sodio; 930 ml de H2O |
Tabla 1. reactivos especiales.
| Escenario | Temperatura (° C) | Hora | ciclos |
| UN | 98 | 30 s | 1 |
| segundo | 98 | 10 s | 25 |
| 60 | 30 s | ||
| 72 | 15 s | ||
| do | 72 | 10 minutos | 1 |
Tabla 2.Generación de la biblioteca de amplificación pasos.
| Cebador | Secuencia |
| 1.1 imprimación | AATGATACGGCGACCACCGAGAT |
| 2.1 imprimación | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
Tabla 3. Los cebadores de PCR.
| Escenario | Temperatura (° C) | Hora | ciclos |
| UN | 95 | 10 minutos | 1 |
| segundo | 95 | 10 s | 40 |
| 60 |
Tabla 4. Biblioteca de cuantificación de amplificación Pasos.
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Discussion
Este protocolo está diseñado para cuantificar miRNAs y otros sRNAs por secuenciación de alto rendimiento o PCR en tiempo real sobre el HDL altamente puro. Al igual que con cualquier enfoque, las consideraciones especiales se deben dar a cada paso en el proceso de purificación de HDL y ARN y luego cuantificar sRNAs. Este protocolo está diseñado para los proyectos iniciados con ≥ 2 ml de plasma. Sin embargo, los análisis de ARN de alta calidad con éxito se pueden completar con HDL purificada a partir de tan poco como 80 l de plasma humano o de ratón usando cromatografía de afinidad; Sin embargo, los volúmenes de plasma de partida más grandes producen mejores datos utilizando los métodos que aquí se presentan. métodos de procesamiento y extracción de la muestra pueden alterar drásticamente la calidad de miARN / sRNA y el rendimiento. El uso de anticoagulantes, si bien son esenciales para la recogida de plasma, probablemente afecta a la extracción de aguas abajo. Por ejemplo, la heparina no se quita fácilmente durante la extracción de RNA 14,15, y puede inhibir las enzimas aguas abajo utilizados en PCR 16-18. Además, THERE informes de que el citrato de sodio también puede interferir con las mediciones de qPCR donde se muestran miRNAs de muestras de EDTA haber mejorado perfil de expresión en comparación con las muestras de citrato de sodio 16,19,20. Estos estudios demuestran la necesidad de una cuidadosa consideración al elegir un anticoagulante. Por otra parte, debido al aumento del potencial de la lisis celular durante la coagulación, las muestras de suero no se recomiendan como miRNAs celulares lisadas puede asociar artificialmente con lipoproteínas. Del mismo modo, el plasma tiene una ubicación aislada de la sangre entera inmediatamente para evitar la contaminación de otras células de sangre periférica, incluyendo leucocitos lisadas. Como temperatura fría es ampliamente conocido por afectar a la activación de plaquetas, muestras de sangre completa se centrifugan lejos de eritrocitos, leucocitos y plaquetas en 3.000 xg durante 15 min a temperatura ambiente. La hemólisis es también poco aconsejable como eritrocitos rotos han sido reportados también para influir en el resultado miARN 21,22, ya que contienen miRNAs que puede ser derramada durante hemolanalysis 23,24. El plasma se puede almacenar a 4 ° C durante 2 - 4 semanas, o, alternativamente, el plasma puede congelarse a -80 ° C, donde el contenido miARN es estable y viable en el corto plazo y almacenamiento a largo plazo (máximo 4 años) 25. Para nuestro conocimiento actual, la congelación de las muestras de plasma no se prevé que dañar HDL-miRNAs y muestras de plasma congeladas son adecuados para analizar. Como las lipoproteínas y otros componentes de sangre entera pueden ser afectados por la ingesta de alimentos, se prefiere el ayuno de recogida de sangre.
Como se mencionó anteriormente, HDL plasma se puede aislar a través de una serie de métodos estándar, incluyendo DGUC, FPLC, y cromatografía de afinidad contra apoA-I. . El aislamiento de las lipoproteínas del plasma por DGUC usando KBr, como se describe por Redgraves et al 26, separa VLDL (d = 0,94 a 1,006 g / ml), LDL (d = 1,006 a 1,063 g / ml) y HDL (d = 1,063 a 1,21 g / ml) y es un método ideal para grandes volúmenes de plasma (2 - 60 ml por muestra). La limitacióna la utilización de este enfoque por sí solo es que se reportan exosomas y otros miARN que contienen vehículos eléctricos tener una densidad similar a la HDL y pueden estar presentes en DGUC HDL (Figura 2A). Otras desventajas incluyen posibles daños estructurales en las proteínas de la exposición de sal en los tampones y las fuerzas de ultracentrifugación fuertes, así como estabilidades diferenciales de HDL subclases 27,28. A pesar de esto, DGUC se usa comúnmente, ya que da como resultado un alto rendimiento de proteína HDL, produciendo cerca de 1 mg de proteína de HDL por 1 ml de plasma 29. El enfoque de FPLC, que implica filtración en gel de exclusión por tamaño, requiere menos tiempo, dependiendo de la velocidad de flujo (aproximadamente 6 h), y tiene una mayor precisión de separación HDL de que contienen apoB lipoproteínas (por tamaño) y sus sub-clases, incluyendo los vehículos eléctricos que son mucho mayores que las HDL, pero tienen densidades similares. Cabe señalar que el uso de los métodos detallados en este protocolo, vesículas de plasma entre aproximadamente 220 a 75 nm de diámetro no hacerproducir una firma lípido o proteína detectable cuando están separados por FPLC. Dependiendo de la configuración, FPLC requiere relativamente pequeño de entrada, 0,3 - 1 ml, que es útil para el plasma de roedores y pequeñas alícuotas congeladas. ensayos de colesterol colorimétricos rápidos también son importantes siguiente FPLC para confirmar la distribución de HDL o de otras fracciones de lipoproteínas. Fraccionamiento diluye muestras y lipoproteínas; Sin embargo, a continuación, las muestras se pueden concentrar usando filtros centrífugos talla estándar (por ejemplo, 10 kDa MW de corte del filtro). aislamiento HDL por apoA-I IP utilizando columnas micro-espín son el más rápido de los tres enfoques, pero están limitados por la entrada baja (0,08 - 1 l) volumen y bajo rendimiento (aproximadamente 0,1 mg). Mientras apoA-I IP puede ser laborioso, este método es ideal para bajo volumen de sobrenadantes de cultivo celular. Si bien cada uno de estos métodos tiene sus fortalezas y debilidades, éstas pueden reducirse si se utiliza en tándem (por ejemplo, DGUC seguido de FPLC). El uso de dos enfoques en tándem, resultados en mayor pureza deHDL para el análisis de miRNA y sRNA.
A continuación, detallamos los pasos necesarios para aislar el HDL de alta pureza utilizando el método tándem de DGUC seguido de FPLC y delineó los pasos utilizados para cuantificar el HDL-miRNAs y sRNAs utilizando secuenciación de alto rendimiento o PCR en tiempo real. Aunque este protocolo fue diseñado para el HDL, tiene gran aplicabilidad en la cuantificación de sRNAs en otras lipoproteínas, incluyendo LDL y VLDL, en función de sus densidades y tamaños.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45 µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
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