Multimodal Imaging og spektroskopi Fiber-bundle Microendoscopy plattform for ikke-invasiv,<em> I Vivo</em> Vevet analyse
Summary
The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.
Abstract
Nylige fiber-bunt microendoscopy Teknikker muliggjør ikke-invasiv analyse av in vivo vev ved hjelp av enten avbildningsteknikker, eller en kombinasjon av spektroskopiteknikk. Ved å kombinere avbildning og spektroskopiteknikker i en enkelt optisk sonde kan gi en mer fullstendig analyse av vev helse. I denne artikkelen er to ulike modaliteter kombinert med høy oppløsning fluorescens microendoscopy bildebehandling og diffuse spektroskopi, i en enkelt optisk probe. Høy oppløsning fluorescens microendoscopy bildebehandling er en teknikk som brukes til å visualisere apikale vev mikro-arkitektur og, selv om det meste en kvalitativ metode, har vist effektiv i sanntid differensiering mellom neoplastiske og ikke-neoplastisk vev. Diffus refleksjonsspektroskopi er en teknikk som kan trekke vev fysiologiske parametre inkludert lokale hemoglobinkonsentrasjon, melanin konsentrasjon, og oksygenmetning. Denne artikkelen beskriver spesifikasjonene required å bygge fiberoptisk sonde, hvordan å bygge instrumentering, og viser deretter teknikken på in vivo menneskelig hud. Dette arbeidet viste at vevet mikroarkitektur, spesielt apikale hud keratinocytter, kan være co-registrert med tilhørende fysiologiske parametere. Instrumenteringen og fiberbunten sonde presentert her kan optimaliseres som enten en håndholdt eller endoskopisk-kompatibel enhet for bruk i en rekke forskjellige organsystemer. Ytterligere klinisk forskning er nødvendig for å teste levedyktighet av denne teknikken for ulike epitel sykdomstilstander.
Introduction
Fiber-bundle microendoscopy teknikker vanligvis analysere in vivo vev ved hjelp av enten bildeteknikker eller en kombinasjon av spektroskopi teknikker. 1-3 En slik avbildningsteknikk, høy oppløsning fluorescens microendoscopy, kan bildet apikale vev mikro-arkitektur med sub-mobilnettet oppløsning i en liten , mikro felt-of-view, ved hjelp av en aktuell kontrastmiddel som proflavin, fluorescein, eller pyranine blekk. 1,3-11 Denne avbildningsfunksjonalitet har vist lovende kliniske ytelse i kvalitativt skille syke og friske epitelvev i sanntid med lav inter-observatør variabilitet. 8 ganger vil etterforskerne bruke høy oppløsning fluorescens mikroskopi data til å trekke kvantitative funksjoner som celle og kjernefysisk størrelse eller kjertel området, men dette er fortsatt en hovedsakelig kvalitativ teknikk rettet mot å visualisere vev morfologi. 1,3,8- 10 på den annen side, spektroskopiteknikker, sliksom diffuse spektroskopi, er rettet mot å gi funksjonell vev informasjon og har vist lovende kliniske prestasjoner i kvantitativt identifisere til kreft i flere organer. 2,12-15
Det er derfor et behov for en anordning som omfatter begge typer modaliteter for potensielt ytterligere redusere inter-observatør variabilitet, opprettholde sanntids visualisering av vev mikro-arkitektur, og tilveiebringe en mer fullstendig analyse av vev helse. For å oppnå dette målet, ble en multimodal probe-basert instrument konstruert som kombinerer to modaliteter i en enkelt fiberoptisk sonde:. Høyoppløselige fluorescens microendoscopy og sub-diffuse spektroskopi 11 Denne metoden co-registrene kvalitative høyoppløselige bilder av apikal vev morfologi (strukturelle egenskaper) med kvantitative spektral informasjon (funksjonelle egenskaper) fra to forskjellige vev dybder inkludert lokale hemoglobinkonsentrasjon ([Hb]), melanin konsentrasjon ([Mel]), og oksygenmetning (SAO 2). 11,12,16 Denne spesifikke under diffuse spektroskopi modalitet bruker to source-detektor separasjoner (SDSS) å prøve to unike vev dybder å gi et mer helhetlig bilde av vev helse ved prøvetaking ned til kjelleren membran og stroma underliggende vev. 11
Den fiber-sonde består av en sentral 1 mm-diameter bilde fiber med ca 50 000 4,5 um diameter fiberelementer, en kledning diameter på 1,1 mm og en total belegg diameter på 1,2 mm. Bildet fiber er omgitt av fem 200 mikrometer diameter fibre med kledningsdiameter på 220 mikrometer. Hvert 200 um flermodusfiber er plassert en senter-til-senter avstand på 864 mikrometer bort fra sentrum av bildet fiber. Hver av de 200 um flermodusfibere er 25 ° fra hverandre. Bruke lengst til venstre 200 mikrometer multimode fiber som "kilden" fiber, og den ekstra thRee 200 um flermodusfibere som "samling" fibre, denne geometrien nødvendigvis skaper tre senter-til-senter HMS-datablade av 374 um, 730 um, 1051 um og 1323 um. Fiberendene er innelukket i en sylindrisk metallkabinett som holder avstanden mellom fibrene konstant. Diameteren av den sylindriske metallinnfatning som er 3 mm. Den distale ende (langs fiberoptisk sonde spissen) av den fiberoptiske sonde er 2 fot lang. Sonden deretter separerer inn i de seks respektive individuelle fibrene ved den proksimale enden (mot instrumentering) som er ytterligere 2 fot lang, for en total lengde på 4 fot. Figur 1 viser en representasjon av den fiberoptiske sonde.
Fig. 1: Fiber-optisk sonde utforming Den fiberoptiske sonde består av en 1 mm diameter bilde fiber og fire 200 um flermodusfibere. DetteFiguren viser representasjoner av (a) den metallendehette som begrenser geometrien av fibrene på sondespissen til dannelse av HMS-datablade av 374, 730 og 1051 um med hensyn til den lengst til venstre 200 um flermodusfiber (Skala bar ≈ 1 mm), (b) fibrene være begrenset innenfor metallhetten, som viser fiberkjerner, fiber kledning, og fiberbelegg (Skala bar ≈ 1 mm), (c) den beskyttende polyamid mantel rundt fibrene (Skala bar ≈ 1 mm), (d ) den ferdige distale spissen av sonden, med metallet fingergrepet og enkelt svart kabel som inneholder alle fibre (Skala ≈ 4 mm), og (e) et bilde av den distale enden av sonden (Skala ≈ 4 mm). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Denne multimodale instrumentering og tilhørende tekque er den første kombinasjonen av disse modaliteter innenfor en enkelt sonde, selv om andre kombinerte strukturelle / funksjonelle teknikker eksisterer som kombinerer forskjellige modaliteter. For eksempel kombinerer hyperspektral avbildning bredt felt bildebehandling med kvantitative hemoglobin og melanin egenskaper, 17,18 og andre teknikker har blitt utviklet som kombinerer optisk koherens tomografi (OCT) med analyse av vev protein uttrykk, 19 for å nevne noen. Artikkelen rapporterer om en kompakt og enkel å implementere instrumentering oppsett som benytter en generell fiberoptisk sonde som kan bli optimalisert for forskjellige formål, inkludert endoskopisk anvendelse i den nedre fordøyelseskanalen og spiserøret, eller som en håndholdt sonde for bruk i munnhulen og ekstern hud plassering. 11,20
Maskinvaren for instrumentering krever både tilpassede datainnsamling og etterbehandling kode for å skaffe diffuse refleksjon spektra og deretter trekke den resulterende volume-gjennomsnitt vev fysiologiske parametere inkludert [Hb], [Mel], og São to. Den tilpassede datainnsamling kode ble bygget for å tillate samtidig oppkjøp fra et kamera (for høy oppløsning fluorescens mikroskopi) og et spektrometer (for diffus spektroskopi). Drivere er ofte tilgjengelig fra produsentens nettsider for å tillate integrasjon med en rekke programmeringsspråk. Den tilpassede post-prosessering kode importerer a priori absorpsjon verdier av in vivo [Hb] og [Mel] 21 og deretter benytter en tidligere utviklet ikke-lineær optimaliseringstilpasningsprosessen som skaper en montert kurve av spektrene. 22 Den tilpassede kurven er bygget ved å minimalisere χ 2 verdi mellom seg selv og den rå spektra og bestemme vev fysiologiske parametere ([Hb], [Mel], og São 2) fra montert kurve og med lavest χ 2 verdi. 22 koden kan endres til å omfatteabsorpsjon fra andre chromophores også, slik som eksogene pyranine blekket som brukes her, slik at målet fysiologiske parametre påvirkes ikke.
Fysiologiske indikatorer på vev helse, som for eksempel [Hb], [Mel], og São 2, kan brukes som rapporter om tumor respons på behandling eller som indikatorer for lokal vascularization og angiogenese. 14,23 Inkludert en høy oppløsning fluorescens microendoscopy modalitet hjelper guide sonde plassering og gir etterforskere med et mer komplett bilde av forholdet mellom epitel vev struktur og funksjon. I denne artikkelen, bygging og bruk av multimodale microendoscope er beskrevet. 11
Protocol
Representative Results
Discussion
Den multimodal høy oppløsning bildebehandling og sub-diffuse spektroskopi fiber-bundle microendoscope rapportert her kan optimaliseres og brukes av etterforskere for en rekke applikasjoner, inkludert endoskopisk eller håndholdt bruk for mennesker eller dyrestudier. Man får altså en fleksibel metode for å visualisere in vivo apikale vev mikro-arkitektur sammen med målinger av hemoglobinkonsentrasjon, melanin konsentrasjon, og vev oksygenmetning fra to forskjellige vev dybder. Denne artikkelen beskri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This material is based on work supported by the National Institutes of Health (1R03-CA182052, 1R15-CA202662), the National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (G.G., DGE-1450079), the Arkansas Biosciences Institute, and the University of Arkansas Doctoral Academy Fellowship. Any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the authors and do not necessarily reflect the views of the acknowledged funding agencies.
Materials
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs, Inc. | CM1-DCH | |
| 470 nm Dichroic Mirror (Beam Splitter) | Chroma Corporation | T470lpxr | |
| Cage Assembly Rod, 1.5", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER1.5-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 3.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER3-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 2.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER2-P4 | |
| SM1-Threaded 30 mm Cage Plate | Thorlabs, Inc. | CP02 | |
| SM1 Series Stress-Free Retaining Ring | Thorlabs, Inc. | SM1PRR | |
| SM1 Lens Tube, 1.00" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L10 | |
| Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs, Inc. | KCB1 | |
| 1" UV Enhanced Aluminum Mirror | Thorlabs, Inc. | PF10-03-F01 | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs, Inc. | SM1Z | |
| 10X Olympus Plan Achromatic Objective | Thorlabs, Inc. | RMS10X | |
| XY Translating Lens Mount | Thorlabs, Inc. | CXY1 | |
| SMA Fiber Adapter Plate with SM1 Thread | Thorlabs, Inc. | SM1SMA | |
| SM1 Lens Tube, 0.50" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L05 | |
| 440/40 Bandpass Filter (Excitation) | Chroma Corporation | ET440/40x | |
| 525/36 Bandpass Filter (Emission) | Chroma Corporation | ET525/36m | |
| Quick Set Epoxy | Loctite | 1395391 | |
| 455 nm LED Light Housing Kit – 3-Watt | LED Supply | ALK-LH-3W-KIT | |
| 1" Achromatic Doublet, f=50mm | Thorlabs, Inc. | AC254-050-A | |
| Flea 3 USB Monochrome Camera | Point Grey, Inc. | FL3-U3-32S2M-CS | |
| 0.5" Post Holder, L = 1.5" | Thorlabs, Inc. | PH1.5 | |
| 0.5" Optical Post, L = 4.0" | Thorlabs, Inc. | TR4 | |
| Mounting Base, 1" x 2.3" x 3/8" | Thorlabs, Inc. | BA1S | |
| Long Lifetime Tungsten-Halogen Light Source (Vis-NIR) | Ocean Optics | HL-2000-LL | |
| 20X Olympus Plan Objective | Edmund Optics, Inc. | PLN20X | |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm Adaptor | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Housing | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Stepper Motor – 400 steps/revolution | SparkFun Electronics | ROB-10846 | Multiple suppliers |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch Face-Plate | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Arduino Uno – R3 | SparkFun Electronics | DEV-11021 | Multiple suppliers |
| Electronic Breadboard – Self-Adhesive | SparkFun Electronics | PRT-12002 | Multiple suppliers |
| EasyDriver – Stepper Motor Driver | Sparkfun Electronics | ROB-12779 | |
| 12V, 229 mA Power Supply | Phihong | PSM03A | Multiple suppliers |
| Enhanced Sensitivity USB Spectrometer (Vis-NIR) | Ocean Optics | USB2000+VIS-NIR-ES | |
| 550 µm, 0.22 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs, Inc. | M37L01 | |
| Custom-Built Fiber-Optic Probe | Myriad Fiber Imaging | N/A | |
| 20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard | Labsphere, Inc. | SRS-20-010 | |
| Standard Yellow Highlighter | Sharpie | 25005 | Multiple suppliers, proflavine or fluorescein can be substituted |
References
- Muldoon, T. J., et al. Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy. Opt Express. 15, 16413-16423 (2007).
- Rajaram, N., Reichenberg, J. S., Migden, M. R., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Pilot clinical study for quantitative spectral diagnosis of non-melanoma skin cancer. Lasers Surg Med. 42, 716-727 (2010).
- Louie, J. S., Richards-Kortum, R., Anandasabapathy, S. Applications and advancements in the use of high-resolution microendoscopy for detection of gastrointestinal neoplasia. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 1789-1792 (2014).
- Chang, S. S., et al. High resolution microendoscopy for classification of colorectal polyps. Endoscopy. 45, 553-559 (2013).
- Muldoon, T. J., et al. Noninvasive imaging of oral neoplasia with a high-resolution fiber-optic microendoscope. Head Neck. 34, 305-312 (2011).
- Muldoon, T. J., et al. Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett’s esophagus. J Biomed Opt. 15, 026027 (2010).
- Prieto, S. P., Powless, A. J., Boice, J. W., Sharma, S. G., Muldoon, T. J. Proflavine Hemisulfate as a Fluorescent Contrast Agent for Point-of-Care Cytology. PLoS One. 10, e0125598 (2015).
- Parikh, N., et al. In vivo diagnostic accuracy of high resolution microendoscopy in differentiating neoplastic from non-neoplastic colorectal polyps: a prospective study. Am J Gastroenterol. 109, 68-75 (2014).
- Shin, D., et al. Quantitative analysis of high-resolution microendoscopic images for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma. Clin Gastroenterol Hepatol. 13, 272-279 (2015).
- Prieto, S. P., et al. Qualitative and quantitative comparison of colonic microendoscopy image features to histopathology. Proc SPIE Int Soc Opt Eng. 9328, (2015).
- Greening, G. J., et al. Fiber-bundle microendoscopy with sub-diffuse reflectance spectroscopy and intensity mapping for multimodal optical biopsy of stratified epithelium. Biomed Opt Express. 6, 4934-4950 (2015).
- Rajaram, N., Gopal, A., Zhang, X., Tunnell, J. W. Experimental validation of the effects of microvasculature pigment packaging on in vivo diffuse reflectance spectroscopy. Lasers Surg Med. 42, 680-688 (2010).
- Spliethoff, J. W., et al. Monitoring of tumor response to cisplatin using optical spectroscopy. Transl Oncol. 7, 230-239 (2014).
- Chang, V. T., et al. Quantitative physiology of the precancerous cervix in vivo through optical spectroscopy. Neoplasia. 11, 325-332 (2009).
- Yu, B., Shah, A., Nagarajan, V. K., Ferris, D. G. Diffuse reflectance spectroscopy of epithelial tissue with a smart fiber-optic probe. Biomed Opt Express. 5, 675-689 (2014).
- Hennessy, R., Goth, W., Sharma, M., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Effect of probe geometry and optical properties on the sampling depth for diffuse reflectance spectroscopy. J Biomedical Opt. 19, 107002 (2014).
- Ghassemi, P., Travis, T. E., Moffatt, L. T., Shupp, J. W., Ramella-Roman, J. C. A polarized multispectral imaging system for quantitative assessment of hypertrophic scars. Biomed Opt Express. 5, 3337-3354 (2014).
- Vasefi, F., et al. Polarization-sensitive hyperspectral imaging in vivo: a multimode dermoscope for skin analysis. Sci Rep. 4, (2014).
- Winkler, A. M., Rice, P. F. S., Drezek, R. A., Barton, J. K. Quantitative tool for rapid disease mapping using optical coherence tomography images of azoxymethane-treated mouse colon. J Biomedl Opt. 15, 041512 (2010).
- Bish, S. F., et al. Handheld Diffuse Reflectance Spectral Imaging (DRSi) for in-vivo characterization of skin. Biomed Opt Express. 5, 573-586 (2014).
- Prahl, S. A. . Optical Absorption of Hemoglobin. , (1999).
- Rajaram, N., et al. Design and validation of a clinical instrument for spectral diagnosis of cutaneous malignancy. Appl Opt. 49, 142-152 (2010).
- Hennessy, R., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Impact of one-layer assumption on diffuse reflectance spectroscopy of skin. J Biomed Opt. 20, 27001 (2015).
- Rajaram, N., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Lookup table-based inverse model for determining optical properties of turbid media. J Biomed Opt. 13, 050501 (2008).
- Nichols, B. S., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Performance of a lookup table-based approach for measuring tissue optical properties with diffuse optical spectroscopy. J Biomed Opt. 17, 057001 (2012).
- Greening, G. J., James, H. M., Muldoon, T. J. . Optical Phantoms: Diffuse and Sub-diffuse Imaging and Spectroscopy Validation. , 1-37 (2015).
- Karsten, A. E., Smit, J. E. Modeling and verification of melanin concentration on human skin type. Photochem Photobiol. 88, 469-474 (2012).
- Glennie, D. L., Hayward, J. E., Farrell, T. J. Modeling changes in the hemoglobin concentration of skin with total diffuse reflectance spectroscopy. J Biomed Opt. 20, 035002 (2015).
- Lim, L., Nichols, B., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Probe pressure effects on human skin diffuse reflectance and fluorescence spectroscopy measurements. J Biomed Opt. 16, 011012 (2011).
