Multimodal Imaging och spektroskopi Fiber-bunt Microendoscopy plattformen för icke-invasiv,<em> In Vivo</em> Vävnadsanalys
Summary
The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.
Abstract
Senaste fiberbunt microendoscopy tekniker möjliggör icke-invasiv analys av in vivo vävnad med användning av antingen avbildningstekniker eller en kombination av spektroskopitekniker. Kombinera avbildning och spektroskopitekniker i en enda optisk sond kan ge en mer fullständig analys av vävnad hälsa. I den här artikeln, är två olika metoder i kombination med hög upplösning fluorescens microendoscopy avbildning och diffus reflektionsspektroskopi, i en enda optisk sond. Högupplöst fluorescens microendoscopy avbildning är en teknik som används för att visualisera apikal vävnadsmikroarkitektur, och även om det mesta en kvalitativ teknik, har visat effektiv realtidsdifferentiering mellan neoplastiska och icke-neoplastisk vävnad. Diffus reflektans-spektroskopi är en teknik som kan extrahera vävnads fysiologiska parametrar inklusive lokal hemoglobinkoncentration, melanin koncentration, och syremättnad. I den här artikeln beskrivs specifikationerna rbligatoriskt att konstruera den fiberoptiska sonden, hur man bygger den instrumentering, och sedan visar tekniken på in vivo människohud. Detta arbete visade att vävnadsmikroarkitekturen, speciellt apikala hudkeratinocyter, kan samtidigt registreras med tillhörande fysiologiska parametrar. Instrumenteringen och fiberknippe sond som presenteras här kan optimeras antingen en handhållen eller endoskopiskt-kompatibel enhet för användning i en mängd olika organsystem. Ytterligare klinisk forskning behövs för att testa lönsamheten av denna teknik för olika epitelceller sjukdomstillstånd.
Introduction
Fiber bunt microendoscopy tekniker analysera typiskt in vivo vävnad med hjälp av antingen avbildningstekniker eller en kombination av spektroskopi tekniker. 1-3 En sådan bildteknik med hög upplösning fluorescens microendoscopy kan bild apikal vävnadsmikroarkitektur med sub-cellulära upplösning i en liten , mikro fält-of-view, med hjälp av en aktuell kontrastmedel såsom proflavin, fluorescein, eller pyranin bläck. 1,3-11 Denna avbildning modalitet har visat lovande kliniska prestanda i kvalitativt skilja sjuka och friska epitelvävnad i realtid med låg inter-observatör variabilitet. 8 ibland kommer utredarna använda högupplösta fluorescensmikroskopi data för att extrahera kvantitativa funktioner såsom cell och nukleära storlek eller körtel område, men detta är fortfarande en främst kvalitativ teknik inriktade på att visualisera vävnadsmorfologin. 1,3,8- 10 Å andra sidan, spektroskopitekniker, såsomsom diffus reflektans spektroskopi, är inriktade på att tillhandahålla funktionell information vävnad och har visat lovande kliniska prestanda i kvantitativt identifiera cancer skador i flera organ. 2,12-15
Därför finns det ett behov av en anordning som innefattar båda typerna av metoder som eventuellt ytterligare minska inter-observatör variabilitet upprätthålla realtid visualisering av vävnadsmikroarkitekturen och ge en mer fullständig analys av vävnad hälsa. För att uppnå detta mål, var en multimodal sondbaserad instrument konstruerat som kombinerar två metoder i en enda fiberoptisk sond. Hög upplösning fluorescens microendoscopy och sub-diffus reflektansspektroskopi 11 Denna metod co-register kvalitativa högupplösta bilder av apikal vävnad morfologi (strukturella egenskaper) med kvantitativ spektral information (funktionella egenskaper) från två olika vävnadsdjup inklusive lokal hemoglobinkoncentration ([Hb]), melanin koncentration ([Mel]), och syremättnad (SAO 2). 11,12,16 Denna specifika sub-diffus reflektansspektroskopi modalitet använder två källdetektor separationer (säkerhetsdatablad) för att sampla två unika vävnadsdjup för att ge en mer heltäckande bild av vävnad hälsa genom provtagning ner till basalmembranet och underliggande vävnad stroma. 11
Fiber sond består av en central 1 mm diameter optisk fiber med cirka 50.000 4,5 um diameter fiberelement, en manteldiameter av 1,1 mm och en total beläggning diameter på 1,2 mm. Den optiska fibern är omgiven av fem 200 um fibrer diameter med beklädnad diameter av 220 pm. Varje 200 pm multimodfiber ligger centrum till centrumavstånd av 864 pm från centrum av den optiska fibern. Var och en av de 200 ^ m multimodfibrer är 25 ° från varandra. Använda den vänstra 200 pm multimodfiber som "källa" fiber, och ytterligare three 200 fim multimodfibrer som "insamlings" fibrer, denna geometri nödvändigtvis skapar tre centrum-till-centrum säkerhetsdatablad av 374 um, 730 um, 1051 um och 1323 um. De fiberspetsarna är inneslutna i ett cylindriskt metallhölje som håller avstånden mellan fibrerna konstant. Diametern hos det cylindriska metallhöljet är 3 mm. Den distala änden (i riktning mot den fiberoptiska sondspets) av den fiberoptiska proben är 2 fot lång. Sonden separerar sedan in i de sex respektive enskilda fibrerna vid den proximala änden (i riktning mot den instrumentering) som är ytterligare 2 fot lång, med en totallängd av 4 fot. Figur 1 visar en representation av den fiberoptiska proben.
Figur 1:. Fiberoptiska sond konstruktion Den fiberoptiska proben består av en 1 mm diameter optisk fiber och fyra 200 | j, m multimodfibrer. DettaFiguren visar representationer av (a) den metall ändkåpa som begränsar geometrin för fibrerna vid sondspetsen till att ge säkerhetsdatablad av 374, 730, och 1051 | j, m med avseende på den längst till vänster 200 fim multimodfiber (Skalstreck ≈ 1 mm), (b) att fibrerna att begränsas inom metallocket, som visar fiberkärnorna, fibermantel och fiberbeläggningen (Skalstreck ≈ 1 mm), (c) den skyddande polyamid mantling kring fibrer (Skalstreck ≈ 1 mm), (d ) den färdiga distala spetsen av sonden, med metallfingergreppet och enda svart kabel som innehåller alla fibrer (Skalstreck ≈ 4 mm), och (e) en bild av den distala spetsen av sonden (Skalstreck ≈ 4 mm). klicka här för att se en större version av denna siffra.
Detta multimodala instrumentering och tillhörande tekque är den första kombinationen av dessa metoder inom en enda sond, även om andra kombinerade strukturella / funktionella tekniker existerar som kombinerar olika former. Till exempel, hyperspektral avbildning kombinerar vidvinkel avbildning med kvantitativa hemoglobin och melanin egenskaper, 17,18 och andra tekniker har utvecklats som kombinerar optisk koherens tomografi (OCT) med analys av vävnadsproteinuttryck, 19 för att nämna några. Denna artikel rapporterar om en kompakt och enkel att implementera instrumentering installation som använder en allmän fiberoptisk sond som kan optimeras för olika syften, inklusive endoskopisk användning i den nedre mag-tarmkanalen och matstrupen eller som en handhållen sond för användning i munhålan och extern hud placering. 11,20
Hårdvaran för denna instrumentering kräver både anpassade datainsamling och efterbearbetning kod för att få diffus reflektans spektra och sedan extrahera den resulterande volume-genomsnitt vävnads fysiologiska parametrar, bland annat [Hb], [Mel] och SAO 2. Den anpassade datainsamling kod byggdes för att tillåta samtidig förvärv från en kamera (för hög upplösning fluorescensmikroskopi) och en spektrometer (för diffus reflektans spektroskopi). Drivrutiner är ofta tillgängliga från tillverkarnas webbplatser för att möjliggöra integration med en mängd olika programmeringsspråk. Den anpassade efterbehandling kod importerar a priori absorptionsvärden in vivo [Hb] och [Mel] 21 och sedan använder en tidigare utvecklat ickelinjär optimering anpassningsprocessen som skapar en anpassad kurva av spektrat. 22 anpassade kurvan byggs genom att minimera χ värde 2 mellan sig själv och den råa spektra och bestämning av vävnads fysiologiska parametrar ([Hb], [Mel] och SAO 2) från den anpassade kurvan och med den lägsta χ 2 värde. 22 koden kan modifieras för att innefattaabsorption från andra kromoforer liksom, såsom exogena pyranin bläck som används här, så att mål fysiologiska parametrar påverkas inte.
Fysiologiska indikatorer på vävnads hälsa, såsom [Hb], [Mel] och SAO 2, kan användas som rapporter av tumörrespons på terapi eller som indikatorer på lokal vaskularisering och angiogenes. 14,23 Inklusive en högupplösande fluorescens microendoscopy modalitet hjälper guide sondplacering och ger utredarna med en mer fullständig bild av förhållandet mellan epitelvävnad struktur och funktion. I den här artikeln, konstruktion och tillämpning av den multimodala microendoscope beskrivs. 11
Protocol
Representative Results
Discussion
Den multimodala högupplösta avbildning och sub-diffus reflektansspektroskopi fiberknippe microendoscope redovisas här kan optimeras och används av forskare för en mängd olika tillämpningar, inklusive endoskopisk eller handhållen användning för mänskliga eller djurstudier. Det ger således en flexibel metod för att visualisera in vivo apikal vävnadsmikroarkitektur tillsammans mätningar av hemoglobinkoncentration, melanin koncentration och vävnadssyremättnad från två olika vävnadsdjup. I …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This material is based on work supported by the National Institutes of Health (1R03-CA182052, 1R15-CA202662), the National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (G.G., DGE-1450079), the Arkansas Biosciences Institute, and the University of Arkansas Doctoral Academy Fellowship. Any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the authors and do not necessarily reflect the views of the acknowledged funding agencies.
Materials
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs, Inc. | CM1-DCH | |
| 470 nm Dichroic Mirror (Beam Splitter) | Chroma Corporation | T470lpxr | |
| Cage Assembly Rod, 1.5", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER1.5-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 3.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER3-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 2.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER2-P4 | |
| SM1-Threaded 30 mm Cage Plate | Thorlabs, Inc. | CP02 | |
| SM1 Series Stress-Free Retaining Ring | Thorlabs, Inc. | SM1PRR | |
| SM1 Lens Tube, 1.00" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L10 | |
| Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs, Inc. | KCB1 | |
| 1" UV Enhanced Aluminum Mirror | Thorlabs, Inc. | PF10-03-F01 | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs, Inc. | SM1Z | |
| 10X Olympus Plan Achromatic Objective | Thorlabs, Inc. | RMS10X | |
| XY Translating Lens Mount | Thorlabs, Inc. | CXY1 | |
| SMA Fiber Adapter Plate with SM1 Thread | Thorlabs, Inc. | SM1SMA | |
| SM1 Lens Tube, 0.50" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L05 | |
| 440/40 Bandpass Filter (Excitation) | Chroma Corporation | ET440/40x | |
| 525/36 Bandpass Filter (Emission) | Chroma Corporation | ET525/36m | |
| Quick Set Epoxy | Loctite | 1395391 | |
| 455 nm LED Light Housing Kit – 3-Watt | LED Supply | ALK-LH-3W-KIT | |
| 1" Achromatic Doublet, f=50mm | Thorlabs, Inc. | AC254-050-A | |
| Flea 3 USB Monochrome Camera | Point Grey, Inc. | FL3-U3-32S2M-CS | |
| 0.5" Post Holder, L = 1.5" | Thorlabs, Inc. | PH1.5 | |
| 0.5" Optical Post, L = 4.0" | Thorlabs, Inc. | TR4 | |
| Mounting Base, 1" x 2.3" x 3/8" | Thorlabs, Inc. | BA1S | |
| Long Lifetime Tungsten-Halogen Light Source (Vis-NIR) | Ocean Optics | HL-2000-LL | |
| 20X Olympus Plan Objective | Edmund Optics, Inc. | PLN20X | |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm Adaptor | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Housing | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Stepper Motor – 400 steps/revolution | SparkFun Electronics | ROB-10846 | Multiple suppliers |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch Face-Plate | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Arduino Uno – R3 | SparkFun Electronics | DEV-11021 | Multiple suppliers |
| Electronic Breadboard – Self-Adhesive | SparkFun Electronics | PRT-12002 | Multiple suppliers |
| EasyDriver – Stepper Motor Driver | Sparkfun Electronics | ROB-12779 | |
| 12V, 229 mA Power Supply | Phihong | PSM03A | Multiple suppliers |
| Enhanced Sensitivity USB Spectrometer (Vis-NIR) | Ocean Optics | USB2000+VIS-NIR-ES | |
| 550 µm, 0.22 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs, Inc. | M37L01 | |
| Custom-Built Fiber-Optic Probe | Myriad Fiber Imaging | N/A | |
| 20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard | Labsphere, Inc. | SRS-20-010 | |
| Standard Yellow Highlighter | Sharpie | 25005 | Multiple suppliers, proflavine or fluorescein can be substituted |
References
- Muldoon, T. J., et al. Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy. Opt Express. 15, 16413-16423 (2007).
- Rajaram, N., Reichenberg, J. S., Migden, M. R., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Pilot clinical study for quantitative spectral diagnosis of non-melanoma skin cancer. Lasers Surg Med. 42, 716-727 (2010).
- Louie, J. S., Richards-Kortum, R., Anandasabapathy, S. Applications and advancements in the use of high-resolution microendoscopy for detection of gastrointestinal neoplasia. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 1789-1792 (2014).
- Chang, S. S., et al. High resolution microendoscopy for classification of colorectal polyps. Endoscopy. 45, 553-559 (2013).
- Muldoon, T. J., et al. Noninvasive imaging of oral neoplasia with a high-resolution fiber-optic microendoscope. Head Neck. 34, 305-312 (2011).
- Muldoon, T. J., et al. Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett’s esophagus. J Biomed Opt. 15, 026027 (2010).
- Prieto, S. P., Powless, A. J., Boice, J. W., Sharma, S. G., Muldoon, T. J. Proflavine Hemisulfate as a Fluorescent Contrast Agent for Point-of-Care Cytology. PLoS One. 10, e0125598 (2015).
- Parikh, N., et al. In vivo diagnostic accuracy of high resolution microendoscopy in differentiating neoplastic from non-neoplastic colorectal polyps: a prospective study. Am J Gastroenterol. 109, 68-75 (2014).
- Shin, D., et al. Quantitative analysis of high-resolution microendoscopic images for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma. Clin Gastroenterol Hepatol. 13, 272-279 (2015).
- Prieto, S. P., et al. Qualitative and quantitative comparison of colonic microendoscopy image features to histopathology. Proc SPIE Int Soc Opt Eng. 9328, (2015).
- Greening, G. J., et al. Fiber-bundle microendoscopy with sub-diffuse reflectance spectroscopy and intensity mapping for multimodal optical biopsy of stratified epithelium. Biomed Opt Express. 6, 4934-4950 (2015).
- Rajaram, N., Gopal, A., Zhang, X., Tunnell, J. W. Experimental validation of the effects of microvasculature pigment packaging on in vivo diffuse reflectance spectroscopy. Lasers Surg Med. 42, 680-688 (2010).
- Spliethoff, J. W., et al. Monitoring of tumor response to cisplatin using optical spectroscopy. Transl Oncol. 7, 230-239 (2014).
- Chang, V. T., et al. Quantitative physiology of the precancerous cervix in vivo through optical spectroscopy. Neoplasia. 11, 325-332 (2009).
- Yu, B., Shah, A., Nagarajan, V. K., Ferris, D. G. Diffuse reflectance spectroscopy of epithelial tissue with a smart fiber-optic probe. Biomed Opt Express. 5, 675-689 (2014).
- Hennessy, R., Goth, W., Sharma, M., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Effect of probe geometry and optical properties on the sampling depth for diffuse reflectance spectroscopy. J Biomedical Opt. 19, 107002 (2014).
- Ghassemi, P., Travis, T. E., Moffatt, L. T., Shupp, J. W., Ramella-Roman, J. C. A polarized multispectral imaging system for quantitative assessment of hypertrophic scars. Biomed Opt Express. 5, 3337-3354 (2014).
- Vasefi, F., et al. Polarization-sensitive hyperspectral imaging in vivo: a multimode dermoscope for skin analysis. Sci Rep. 4, (2014).
- Winkler, A. M., Rice, P. F. S., Drezek, R. A., Barton, J. K. Quantitative tool for rapid disease mapping using optical coherence tomography images of azoxymethane-treated mouse colon. J Biomedl Opt. 15, 041512 (2010).
- Bish, S. F., et al. Handheld Diffuse Reflectance Spectral Imaging (DRSi) for in-vivo characterization of skin. Biomed Opt Express. 5, 573-586 (2014).
- Prahl, S. A. . Optical Absorption of Hemoglobin. , (1999).
- Rajaram, N., et al. Design and validation of a clinical instrument for spectral diagnosis of cutaneous malignancy. Appl Opt. 49, 142-152 (2010).
- Hennessy, R., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Impact of one-layer assumption on diffuse reflectance spectroscopy of skin. J Biomed Opt. 20, 27001 (2015).
- Rajaram, N., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Lookup table-based inverse model for determining optical properties of turbid media. J Biomed Opt. 13, 050501 (2008).
- Nichols, B. S., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Performance of a lookup table-based approach for measuring tissue optical properties with diffuse optical spectroscopy. J Biomed Opt. 17, 057001 (2012).
- Greening, G. J., James, H. M., Muldoon, T. J. . Optical Phantoms: Diffuse and Sub-diffuse Imaging and Spectroscopy Validation. , 1-37 (2015).
- Karsten, A. E., Smit, J. E. Modeling and verification of melanin concentration on human skin type. Photochem Photobiol. 88, 469-474 (2012).
- Glennie, D. L., Hayward, J. E., Farrell, T. J. Modeling changes in the hemoglobin concentration of skin with total diffuse reflectance spectroscopy. J Biomed Opt. 20, 035002 (2015).
- Lim, L., Nichols, B., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Probe pressure effects on human skin diffuse reflectance and fluorescence spectroscopy measurements. J Biomed Opt. 16, 011012 (2011).
