Een protocol voor het gebruik van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensors te meten mechanische krachten over de Nuclear LINC Complex
Summary
A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.
Abstract
The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.
Introduction
Kracht-gevoelige, zijn genetisch gecodeerde FRET sensoren recentelijk naar voren gekomen als een belangrijk instrument voor het meten van treksterkte gebaseerde krachten in levende cellen, inzicht in hoe mechanische krachten in eiwitten 1, 2, 3, 4 aangebracht. Met deze tools, kunnen onderzoekers het niet-invasief intracellulaire krachten in levende cellen met behulp van conventionele tl-microscopen. Deze sensoren bestaan uit een FRET-paar (donor en acceptor fluorescerende eiwitten, meestal een blauwe donor en acceptor geel) gescheiden door een elastisch peptide 3. In tegenstelling tot de C- of N-terminale tagging, wordt deze sensor ingebracht in een interne plaats van een eiwit om de mechanische kracht overgebracht in het eiwit te meten, gedraagt als een moleculaire spanningsmeter. Verhoogde mechanische spanning over de sensor resulteert in een grotere afstand tussen de FRET-plucht, wat resulteert in verminderde FRET 3. Hierdoor wordt de FRET omgekeerd evenredig met trekkracht.
Deze fluorescerende gebaseerde sensoren zijn ontwikkeld voor focale adhesie-eiwitten (vinculin 3 en talin 4), cytoskeletproteïnen (α-actinine 5) en cel- junction eiwitten (E-Cadherine 6, 7, VE-cadherine 8 en PECAM 8). De meest gebruikte en goed gekarakteriseerde elastische linker in deze biosensoren heet TSmod en bestaat uit een herhaalde sequentie van 40 aminozuren, (GPGGA) 8, die was afgeleid van de spin zijdeproteïne flagelliform. TSmod is aangetoond gedragen als een lineaire elastische nano-veer, met FRET reactiviteit op 1-5 pN trekkracht 3. Verschillende lengten flagelliform kan worden gebruikt om de dynamische r wijzigenange van TSmod FRET-force gevoeligheid 9. Naast flagelliform, spectrine herhalingen 5 en villin kopstuk peptide (bekend als HP35) 4 werden gebruikt als elastisch peptiden tussen FRET-paren soortgelijke werking biosensoren 4. Tot slot, een recent rapport bleek dat TSmod ook kan worden gebruikt om drukkrachten 10 detecteren.
We hebben onlangs een krachtsensor de linker van de nucleo-cytoskelet (LINC) complex eiwit Nesprin2G ontwikkeld door TSmod ingebracht in een eerder ontwikkelde afgeknot eiwit Nesprin2G zogenaamde mini-Nesprin2G (figuur 2C), die eveneens gedraagt endogene Nesprin-2G 11. LINC complex bevat meerdere eiwitten die leiden vanaf de buitenzijde naar de binnenzijde van de kern, die de cytoplasmatische cytoskelet de nucleaire lamina. Nesprin-2G is een structureel eiwit bindt aan zowel deactine cytoskelet in het cytoplasma en SUN eiwitten in de perinucleaire ruimte. Met behulp van onze biosensor, waren we in staat om aan te tonen dat Nesprin-2G is onderworpen aan actomyosine-afhankelijke spanning in NIH3T3 fibroblasten 2. Dit was de eerste keer dat kracht werd direct gemeten over een eiwit in de nucleaire LINC complex, en het is waarschijnlijk een belangrijk instrument om de rol van kracht op de kern in Mechanobiology begrijpen geworden.
Onderstaande protocol geeft een gedetailleerde methodologie van de Nesprin-2G krachtsensor gebruiken en het uiten van de Nesprin spanningssensor (Nesprin-TS) in zoogdiercellen, en het verzamelen en analyseren van FRET afbeeldingen cellen die Nesprin- TS. Behulp van een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een spectrale detector, een beschrijving van het gesensibiliseerde emissie gemeten FRET gebruikt spectrale ontmenging en ratiometrische FRET beeldvorming verschaft. De output ratiometrische beelden kunnen worden gebruikt om de relatieve qua makenntitative kracht vergelijkingen. Hoewel dit protocol is gericht op de expressie van Nesprin-TS in fibroblasten is gemakkelijk aan andere zoogdiercellen, waaronder beide cellijnen en primaire cellen. Bovendien kan dit protocol als het gaat om beeldacquisitie en FRET analyse gemakkelijk worden aangepast aan andere FRET-gebaseerde biosensoren kracht die zijn ontwikkeld voor andere eiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Werkwijze en demonstratie van live cell imaging van mechanische spanning in Nesprin-2G, een eiwit in de kern LINC complex werd hierboven beschreven. Voorafgaand aan dit werk verschillende technieken, zoals micropipet aspiratie, magnetische-kraal cytometrie en microscopische laser-ablatie, gebruikt om spanning toe te passen op de celkern en de bulk materiaaleigenschappen 16, 17, 18 te meten. Echter, tot onze recente…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Thomas F. en Kate Miller Jeffress Memoria Trust (DEC) en NIH-subsidie R35GM119617 (DEC). De confocale microscoop beeldvorming werd uitgevoerd bij de VCU nanomaterialen karakterisering Core (NCC) Facility.
Materials
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35mm Dish with 20mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein,plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
- Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, 5101-5109 (2013).
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
- Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
- Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, 261-269 (2011).
- Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
- Cai, D., Chen, S. -. C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
- Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
- Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
- Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, 4099-4108 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
- Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
- Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
- Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
- Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
- Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
- Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), 956-959 (2010).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, 139-152 (2007).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).
