Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için
Summary
A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.
Abstract
The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.
Introduction
Kuvvet-duyarlı, genetik olarak kodlanmış FRET sensörler, yakın, canlı hücrelerde çekme bazlı kuvvetleri olarak proteinler, 1, 2, 3, 4 arasında nasıl uygulandığı mekanik kuvvetlerin fikir sağlamak için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu araçları ile, araştırmacılar geleneksel floresan mikroskop kullanılarak canlı hücreler içinde, non-invaziv görüntü hücre içi kuvvetler can. Bu sensörler bir elastik peptid 3 ile ayrılmış bir FRET çiftinin (donör ve akseptör floresan proteinleri, en çok mavi bir verici ve sarı akseptör) oluşur. C- veya N-terminal etiketleme aksine, bu sensor, bir molekül gerilme göstergesi gibi davranmak, protein üzerinden iletilen mekanik kuvvetini ölçmek için bir proteinin bir iç alanı içine eklenir. FRET p arasında artan bir mesafe sensörü sonuçları arasında mekanik gerilim artışıhava, azalmış FRET 3 elde edilir. Bunun bir sonucu olarak, FRET ters gerilme kuvveti ile ilgilidir.
Bu flüoresan bazlı sensörler fokal yapışma proteinleri (vinkülin 3 ve talin 4), sitoskeletal proteinler (α-aktinin 5), ve hücre-hücre birleşme proteinleri için geliştirilmiştir (E-kadherin 6, 7, VE-cadherin 8 ve PECAM 8). Bu biyoalgılayıcılarda da en sık kullanılan ve iyi karakterize edilmiş esnek bağlayıcı TSmod olarak bilinir ve örümcek ipeği proteini flagelliform türetilmiş 40 amino asitlik (GPGGA) 8, bir tekrarlanan dizinin oluşur. TSmod çekme kuvveti 3 5 pN için 1 FRET yanıtı, bir doğrusal elastik nano yay olarak hareket ettiği gösterilmiştir. flagelliform farklı uzunlukları dinamik r değiştirmek için kullanılabilirTSmod FRET kuvvet duyarlılık 9 ange. Flagelliform ek olarak, spektrin (HP-35 olarak da bilinir) 5 ve villin başlık peptid 4 içindeki kuvvet biyosensörler 4 FRET çifti arasındaki elastik peptidler olarak kullanılmıştır tekrarlar. Son olarak, son bir yay TSmod da sıkıştırma kuvvetlerini 10 algılamak için kullanılabileceğini gösterdi.
Son zamanlarda TSmod endojen benzer şekilde davranır mini Nesprin2G (Şekil 2C), olarak bilinen, daha önce geliştirilmiş kesik Nesprin2G protein içine sokulur kullanılarak Nucleo-hücre iskeletinin (LINC) kompleks protein Nesprin2G bağlayıcısına için bir güç sensörü gelişmiş Nesprin-2G 11. LINC kompleksi, nükleer lamina sitoplazmik hücre iskeleti bağlama, çekirdeğin içine dışarıdan yol açan birçok proteinler içerir. Nesprin-2G yapısal bir protein bağlanma her ikisitoplazmada ve çekirdek çevresi alanı GÜNEŞ proteinlerine aktin hücre iskeletinin. Bizim biyosensör kullanarak, Nesprin-2G NIH3T3 fibroblastların 2'de actomyosin bağımlı gerilim tabi olduğunu göstermek başardık. Bu, o kuvvet direkt olarak nükleer LINC kompleksi içinde bir protein karşısında ölçüldü ilk kez oldu ve mechanobiology içinde çekirdeği üzerinde gücünün rolünü anlamak için önemli bir araç haline muhtemeldir.
Aşağıdaki protokol, Nesprin- ifade eden hücrelerin FRET görüntülerin memeli hücrelerinde Nesprin gerilim sensörü (Nesprin-TS) ifadesi, hem de toplama ve analizi de dahil olmak, Nesprin-2G güç sensörü nasıl kullanılacağını detaylı bir yöntem sağlar TS. bir spektral detektörü ile donatılmış bir ters konfokal mikroskop kullanılarak, duyarlı emisyon ölçmek için nasıl bir açıklama spektral Karışmama kullanılarak FRET ve rasyometrik FRET görüntüleme sağlanır. çıkış oran ölçer görüntüleri göreceli nereye yapmak için kullanılabilirntitative kuvvet karşılaştırmaları. Bu protokol, fibroblastlarda Nesprin-TS ekspresyonu odaklanmış olsa da, bu hücre hatları ve primer hücreler de dahil olmak diğer memeli hücreleri, kolayca adapte edilebilir. Bundan başka, bu görüntü elde etme ve FRET analizi ile ilgili olarak, bu protokol, hali hazırda diğer proteinler için geliştirilmiştir, diğer FRET'e dayalı bir kuvvet biyosensör için adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir yöntem ve Nesprin-2G, nükleer LINC kompleksi içinde bir protein karşısında mekanik gerilimin canlı hücre görüntüleme gösteri, yukarıda özetlenen edildi. Bundan önce işe, örneğin mikropipet aspirasyon sitometrisi manyetik boncuk ve mikroskopik lazer ablasyon gibi çeşitli teknikler, hücre çekirdeği üzerindeki yükü uygulamak ve dökme malzeme özellikleri 16, 17, 18 ölçmek için kullanılmıştır. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, (DEC) R35GM119617 vermek Thomas F. ve Kate Miller Jeffress Memoria (DEC) güven ve NIH tarafından desteklenmiştir. konfokal mikroskop görüntüleme VCU Nanomaterials Karakterizasyonu Çekirdek (KKK) Tesisinde gerçekleştirilmiştir.
Materials
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35mm Dish with 20mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein,plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
- Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, 5101-5109 (2013).
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
- Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
- Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, 261-269 (2011).
- Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
- Cai, D., Chen, S. -. C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
- Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
- Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
- Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, 4099-4108 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
- Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
- Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
- Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
- Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
- Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
- Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), 956-959 (2010).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, 139-152 (2007).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).
