原子力LINCコンプレックス全体に機械的な力を測定するために、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）-forceのバイオセンサーを使用するためのプロトコル
Summary
A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.
Abstract
The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.
Introduction
力の影響を受けやすい、遺伝的にコードされたFRETセンサーは、最近、生細胞の引張ベースの力を測定するタンパク質1、2、3、4の両端に印加されている方法を機械的な力への洞察を提供するための重要なツールとして浮上しています。これらのツールを使用して、研究者は、従来の蛍光顕微鏡を使用して、生きた細胞における非侵襲的に画像細胞内力することができます。これらのセンサは、弾性ペプチド3によって分離されたFRET対（ドナー及びアクセプター蛍光タンパク質、最も頻繁青色ドナーおよびアクセプタ黄色）から成ります。 C-またはN末端タグとは対照的に、このセンサーは、分子歪みゲージとして挙動、タンパク質を横切って伝達される機械的な力を測定するためにタンパク質の内部部位に挿入されます。 FRET-Pとの間の距離の増加にセンサ結果を横切って機械的張力を増加させ空気減少FRET 3で得られました。結果として、FRETは逆の引張力に関連しています。
これらの蛍光ベースのセンサは、焦点接着タンパク質（ビンキュリン3及びタリン4）、細胞骨格タンパク質（αアクチニン5）のために開発されており、細胞-細胞接合タンパク質（E-カドヘリン6、 図7は 、VEカドヘリン8、及びPECAM 8）。これらのバイオセンサーにおいて最も頻繁に使用され、よく特徴付け弾性リンカーはTSmodとして知られており、スパイダーシルクタンパク質の鞭毛から得られた40個のアミノ酸、（GPGGA）8、の反復配列から構成されています。 TSmod引張力3の1〜5 pNでのFRET応答と、線形弾性ナノスプリングとして動作することが示されています。鞭毛の異なる長さは、動的Rを変更するために使用することができますTSmod FRET力感度9のアンジュ。鞭毛に加えて、スペクトリンは、（HP35として知られている）5とビリンヘッドピースペプチド4を繰り返し、同様の力バイオセンサ4におけるFRET対の間に弾性ペプチドとして使用されてきました。最後に、最近の報告ではTSmodも圧縮力10を検出するために使用することができることを示しました。
我々は最近、内因性と同様に動作ミニNesprin2G（ 図2C）として知られている、以前に開発された切断型Nesprin2Gタンパク質に挿入TSmodを使用して、核-細胞骨格（LINC）複合タンパク質Nesprin2Gのリンカーの力センサを開発しましたNesprin-2G 11。 LINC複合体は核ラミナに細胞質細胞骨格をつなぐ、核の外側から内側につながる複数のタンパク質が含まれています。 Nesprin-2Gは、両方に結合する構造タンパク質であります細胞質内及び核周囲空間にSUNタンパク質へのアクチン細胞骨格。私たちのバイオセンサーを使用して、我々はNesprin-2Gは、NIH3T3線維芽細胞2におけるアクトミオシン依存テンションの対象であることを示すことができました。これは、その力は直接核LINC複合体中のタンパク質間で測定した初めてだったし、メカノにおける核の力の役割を理解するための重要なツールになる可能性があります。
以下のプロトコルは、哺乳動物細胞におけるNesprin張力センサ（Nesprin-TS）の発現を含むNesprin-2G力センサ、ならびにNesprin-を発現する細胞のFRET画像の取得および分析を使用する方法の詳細な方法を提供しますTS。スペクトル検出器を備えた倒立共焦点顕微鏡を使用して、スペクトルアンミキシング及びレシオメトリックFRETイメージングを用いて増感発光FRETを測定する方法の説明が提供されます。出力レシオメトリック画像は相対的な資格を作るために使用することができますntitative力の比較。このプロトコルは、線維芽細胞におけるNesprin-TSの発現に焦点を当てているが、それは、細胞株および初代細胞の両方を含む他の哺乳動物細胞に容易に適合可能です。また、画像取得およびFRET分析に関連するこのプロトコルは、容易に他のタンパク質のために開発された他のFRETベースの力のバイオセンサーに適用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
Nesprin-2G、核LINC複合体中のタンパク質を横切る機械的張力の生細胞イメージングの方法及び実証は、上記に概説しました。前にこの作業を、そのようなマイクロピペット吸引、フローサイトメトリー、磁気ビーズ、および顕微鏡レーザアブレーションのような種々の技術が、細胞核に歪みを適用するために、そのバルク材料特性16、17、18</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、トーマスF.と（12月に）ケイト・ミラー・ジェフレスメモリア信託（DEC）はNIH助成金R35GM119617によってサポートされていました。共焦点顕微鏡イメージングはVCUナノキャラクタリゼーションコア（NCC）施設で行いました。
Materials
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35mm Dish with 20mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein,plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
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