포스터 공명 에너지 전달 (FRET) -force의 바이오 센서를 사용하는 프로토콜은 핵 LINC 단지에서 기계의 힘을 측정하는
Summary
A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.
Abstract
The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.
Introduction
포스 성 유전자 부호화 FRET 센서 최근 생균 인장 계의 힘을 측정하는 단백질 1, 2, 3, 4에인가되는 방법을 기계적 힘에 대한 통찰력을 제공하기위한 중요한 도구로 떠오르고있다. 이러한 도구를 사용하여, 연구자들은 기존의 형광 현미경을 이용하여 살아있는 세포에서 비 침습적 영상 세포 내 힘 수 있습니다. 이러한 센서는 탄성 펩티드 (3)에 의해 분리 된 FRET 쌍 (도너와 억 셉터 형광 단백질, 자주 청색 공여체 및 수용체 노란색)로 구성된다. C- 또는 N- 말단 태그 대조적으로,이 센서는 분자 스트레인 게이지로서 행동하고,이 단백질에 걸쳐 전송되는 기계적인 힘을 측정 할 수있는 단백질의 내부 부위에 삽입된다. 프렛-P 사이의 증가 된 거리에서 센서 결과 걸쳐 기계적 장력을 증대공기 감소 FRET 3의 결과. 그 결과, FRET 반비례 인장력에 관한 것이다.
이러한 형광 기반 센서는 초점 접착 단백질 (vinculin 3 talin 4), 세포 골격 단백질 (α-티닌 5), 및 세포 – 세포 접합 단백질을 위해 개발 된 (E-cadherin의 6, 7, VE-cadherin의 8 및 PECAM 8). 이러한 바이오 센서에서 가장 자주 사용되는 잘 특징으로하는 탄성 링커 TSmod라고도하고 거미줄 단백질 flagelliform로부터 유도 된 40 개 아미노산 (GPGGA) (8)의 반복되는 시퀀스로 구성된다. TSmod은 인장력 3/5 PN 1 FRET에 응답하여 선형 탄성 나노 스프링처럼 행동하는 것으로 나타났다. flagelliform의 다른 길이는 동적 R을 변경하는 데 사용할 수 있습니다TSmod FRET 힘 감도 (9)의 플랜지. flagelliform 외에도 스펙 트린은 (HP35라고도 함) (5)와 villin 투구 펩티드 4는 유사한 포스 바이오 센서 (4) 사이의 FRET 쌍 탄성 펩티드로서 사용되어왔다를 반복한다. 마지막으로, 최근의 보고서는 TSmod는 압축력 (10)를 감지하는 데 사용할 수 있다는 것을 보여 주었다.
최근 TSmod 내생 비슷하게 동작 미니 Nesprin2G (도 2C)로 알려진 이전에 개발 된 절두 Nesprin2G 단백질 삽입 이용하여 nucleo – 골격 (LINC) 복합 단백질 Nesprin2G의 링커 힘 센서를 개발 Nesprin-2G (11). LINC 복합체는 핵에 얇은 골격을 연결하는 세포질, 핵의 외부에서 내부로 이끌어 다중 단백질을 포함한다. Nesprin-2G는 구조적 단백질에 결합되는 두세포질과 핵 주변 공간에 태양 단백질 액틴 세포 골격. 우리의 바이오 센서를 사용하여, 우리는 Nesprin-2G는 NIH3T3 섬유 아세포 2 액토 마이 오신에 의존 긴장 될 수 있음을 보여줄 수 있었다. 이것은 그 힘이 바로 핵 LINC 단지에 단백질을 통해 측정 한 처음, 그리고 제어 공학의 핵에 힘의 역할을 이해하는 중요한 도구가 될 가능성이 높습니다.
프로토콜은 아래 Nesprin-을 발현하는 세포의 FRET 화상의 포유 동물 세포에서 Nesprin 장력 센서 (Nesprin-TS)의 발현뿐만 아니라, 수집 및 분석을 포함하여 Nesprin-2G 힘 센서를 사용하는 방법의 상세한 방법을 제공한다 TS. 분광 검출기를 구비 한 반전 된 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여, 발광 증감을 측정하는 방법을 설명 unmixing 스펙트럼을 이용하여 비율 적 FRET FRET 및 촬상이 제공된다. 출력 이미지가 상대적 비율 적 …로서 확인하는데 사용될 수있다ntitative 힘 비교. 이 프로토콜은 섬유 아세포 Nesprin-TS의 발현에 집중되는 반면, 세포주 및 일차 전지 모두 포함한 다른 포유 동물 세포에 쉽게 적응할 수있다. 또한, 이미지 수집 및 FRET 분석에 관련된 프로토콜이 용이 다른 단백질에 대해 개발 된 다른 FRET 기반 포스 바이오 센서에 적용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
방법 및 Nesprin-2G 핵 LINC 복잡 단백질 걸쳐 기계적 장력 생균 촬상 시연은 위에서 언급되었다. 이전이 연구에, 이러한 마이크로 피펫 흡인 세포 계측법, 자성 비드, 현미경 레이저 절제와 같은 다양한 기술들은, 세포핵에 변형을 적용하고, 벌크 물성 16, 17, 18을 측정하기 위해 사용되었다. 그러나, 최근의 작품까지, 어떤…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 (DEC에) R35GM119617을 부여 토마스 F.와 케이트 밀러 제프리스 Memoria (DEC에) 신뢰와 NIH에 의해 지원되었다. 공 초점 현미경 영상은 VCU 나노 물질 특성 코어 (NCC) 시설에서 수행되었다.
Materials
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35mm Dish with 20mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein,plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
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