Un protocolo para el uso de Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) y forzar Biosensores para medir fuerzas mecánicas en todo el complejo nuclear de LINC

Summary

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Abstract

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

Introduction

Sensible a la Fuerza, los sensores FRET codificados genéticamente han surgido recientemente como una herramienta importante para la medición de fuerzas de tracción a base de en células vivas, proporcionando información sobre cómo las fuerzas mecánicas son aplicada a través de proteínas de ^{1, 2, 3, 4.} Con estas herramientas, los investigadores pueden tomar imágenes de forma no invasiva fuerzas intracelulares en células vivas utilizando microscopios fluorescentes convencionales. Estos sensores consisten en una FRET-par (proteínas donantes y fluorescentes aceptor, más frecuentemente un donante azul y el aceptor de color amarillo) separados por un péptido elástico ^3. En contraste con C- o etiquetado N-terminal, este sensor se inserta en un sitio interno de una proteína para medir la fuerza mecánica transmitida a través de la proteína, comportándose como un medidor de deformación molecular. Aumento de la tensión mecánica a través de los resultados del sensor en un aumento de la distancia entre la FRET-paire, resultando en la disminución de FRET ^3. Como resultado, la FRET es inversamente proporcional a la fuerza de tracción.

Estos sensores a base de fluorescentes han sido desarrollados para las proteínas de adhesión focal (vinculina ³ y talina ^4), proteínas del citoesqueleto (α-actinina ^5), y proteínas de unión célula-célula (E-cadherina ^{6, 7,} VE-cadherina ^8, y PECAM ^8). El engarce elástico usado con más frecuencia y bien caracterizado en estos biosensores se conoce como TSmod y consiste en una secuencia repetitiva de 40 aminoácidos, (GPGGA) _8, que se deriva de la flagelliform proteína de seda de araña. TSmod se ha demostrado que comportarse como un nano-resorte elástico lineal, con la capacidad de respuesta de FRET a 1 a 5 pN de fuerza de tracción ^3. Diferentes longitudes de flagelliform se pueden utilizar para alterar la dinámica range de sensibilidad TSmod FRET-fuerza ^9. Además de flagelliform, espectrina repite ⁵ y vilina péptido pieza de cabeza (conocido como HP35) ⁴ se han utilizado como los péptidos elásticos entre FRET pares en biosensores fuerza similar ^4. Por último, un informe reciente mostró que TSmod también se puede utilizar para detectar las fuerzas de compresión ^10.

Recientemente hemos desarrollado un sensor de fuerza para el enlazador de la núcleo-citoesqueleto (LINC) complejo de proteínas Nesprin2G utilizando TSmod inserta en una proteína truncada Nesprin2G desarrollado previamente conocida como mini-Nesprin2G (Figura 2C), que se comporta de manera similar a endógena nesprin-2G ^11. El complejo LINC contiene múltiples proteínas que conducen desde el exterior hacia el interior del núcleo, que une el citoesqueleto citoplásmico de la lámina nuclear. Nesprin-2G es vinculante una proteína estructural tanto a lacitoesqueleto de actina en el citoplasma y a las proteínas de sol en el espacio perinuclear. Utilizando nuestro biosensor, hemos sido capaces de demostrar que nesprin-2G está sujeta a la tensión actomyosin depende en fibroblastos NIH3T3 ^2. Esta fue la primera vez que la fuerza se midió directamente a través de una proteína en el complejo LINC nuclear, y es probable que se convierta en una herramienta importante para entender el papel de la fuerza en el núcleo en mecanobiología.

El protocolo a continuación proporciona una metodología detallada de cómo utilizar el sensor de fuerza nesprin-2G, incluyendo la expresión del sensor de tensión nesprin (nesprin-TS) en células de mamífero, así como la adquisición y análisis de imágenes de FRET de células que expresan Nesprin- TS. El uso de un microscopio confocal invertido equipado con un detector espectral, una descripción de cómo medir la emisión sensibilizada FRET usando desmezcla espectral y está provisto de imágenes FRET radiométrica. Las imágenes radiométricas de salida pueden ser usados ​​para hacer qua relativacomparaciones de fuerza ntitative. Mientras que este protocolo se centra en la expresión de nesprin-TS en los fibroblastos, es fácilmente adaptable a otras células de mamífero, incluyendo las dos líneas celulares y células primarias. Además, este protocolo que se refiere a la adquisición de imágenes y el análisis FRET puede adaptarse fácilmente a otros biosensores de fuerza basados ​​en FRET que han sido desarrollados para otras proteínas.

Protocol

1. Obtener ADN Sensor nesprin-2G y otro ADN plásmido Obtener nesprin-2G TS (sensor de tensión) de control, nesprin-2G HL (sin cabeza), mTFP1, venus, y TSmod de una fuente comercial. Propagar todos los plásmidos de ADN y purificarlos usando cepas estándar de E. coli, tales como DH5-α, como se ha descrito previamente 12, 13. 2. Las células transfectar con nesprin-2G y otro ADN plásmido Se cul…

Representative Results

Siguiendo el protocolo anterior, el plásmido de ADN fue adquirido desde el repositorio de ADN y se transformó en células de E. coli. E. coli que expresan el DNA sensor fueron seleccionados de placas LB / ampicilina y se amplificaron en un caldo LB líquido. Después de la amplificación de los vectores, los plásmidos de ADN se purificaron en tampón Tris-EDTA utilizando un estándar, disponible comercialmente kit de aislamiento de ADN. El uso de un espectrofotómetr…

Discussion

Un método y la demostración de imágenes de células vivas de la tensión mecánica a través de nesprin-2G, una proteína en el complejo nuclear de LINC, se esbozó anteriormente. Antes de este trabajo, varias técnicas, tales como la aspiración de micropipeta, magnético en perlas de citometría, y microscópica láser de ablación, se han utilizado para aplicar tensión en el núcleo de la célula y para medir sus propiedades de material a granel ^{16, 17,</s…}

Materials

Nesprin-TS DNA	Addgene	68127	Retrieve from https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNA	Addgene	68128	Retrieve from https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNA	Addgene	54613	Retrieve from https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNA	Addgene	27793	Retrieve from https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNA	Addgene	26021	Retrieve from https://www.addgene.org/26021/
Competent Cells	Bioline	BIO-85026
Liquid LB Media	ThermoFisher	10855001	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Solid LB Bacterial Culture Plates	Sigma-Aldrich	L5667	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US
Ampicillin	Sigma	A9518
Spectrophotometer	Biorad	273 BR 07335	SmartSpec Plus
quartz cuvette	Biorad	1702504	Cuvette for SmartSpec Plus
DNA isolation kit	Macherey-Nagel	740412.5	NucleoBond Xtra Midi Plus
6-well cell culture dish	Falcon-Corning	353046	Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish
Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media	Gibco	11995-065	DMEM(1x)
Bovine Serum	Life Technologies	16170-078
reduced serum cell media	Gibco	31985-070	Reduced Serum Medium, "optimem"
Lipid Carrier Solution	invitrogen	11668-019	Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000"
1.5mL sterile plastic tube	Denville	c2170
Trypsin	Gibco	25200-056	0.25% Trypsin-EDTA (1x)
glass-bottom microscope viewing dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N	35mm Dish with 20mm Bottom Well #1.5 glass
Fibronectin	ThermoFisher	33016015	fibronectin human protein,plasma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15mL sterile centrifuge tube	Greiner bio-one	188261
swinging rotor centrifuge	Thermo electron	Centra CL2	Swinging rotor thermo electron 236
cell culture biosafety hood	Forma Scientific	1284
climate controlled cell culture incubator	ThermoFisher	3596
inverted LED widefield fluorescent microscope	Life technologies	EVOS FL
Clear HEPES buffered imaging media	Molecular Probes	A14291DJ
Fetal bovine Serum	Life technologies	10437-028
Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515nm laser sources	Zeiss	LSM 710-w/spectral META detector
Outgrowth Media	Newengland Biolabs	B9020s
NIH 3T3 Fibroblasts	ATCC	CRL-1658