פרוטוקול באמצעות העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג) חיישנים ביולוגיים -force למדוד כוחות מכניים ברחבי המכלול הגרעיני LINC
Summary
A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.
Abstract
The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.
Introduction
חיל-רגיש, חיישני סריג מקודדים גנטיים צמחו לאחרונה ככלי חשוב למדידת כוחות מבוסס מתיחה בתאים חיים, ומספקים תובנות איך מכני כוחות מוחלים על פני חלבוני 1, 2, 3, 4. באמצעות כלים אלה, חוקרים יכולים דימוי הלא פולשני כוחות תאיים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופי פלורסנט קונבנציונליים. חיישנים אלה מורכבים-זוג סריג (פלורסנט תורם acceptor חלבונים, בתדירות הגבוהה ביותר תורם כחול acceptor הצהוב) המופרדים על ידי פפטיד אלסטי 3. בניגוד C- או N-terminal תיוג, חיישן זה מוכנס לתוך אתר פנימי של חלבון כדי למדוד את הכח המכאני ישודר החלבון, מתנהג כמו מד לחץ מולקולרי. גברת מתח מכאני על פני תוצאות החיישן בעל טווח מוגדל בין-p הסריגאוויר, דבר שגרם לפגיעה סריג 3. כתוצאה מכך, הסריג הוא ביחס הפכו כוח מתיחה.
חיישנים פלורסנט מבוסס אלו פותחו עבור חלבונים דבקים מוקדים (vinculin 3 ו תלין 4), חלבוני cytoskeletal (α-actinin 5), וחלבוני צומת תא-תא (E-cadherin 6, 7, VE-cadherin 8, ו PECAM 8). הנפוץ ביותר בשימוש היטב מאופיין ומקשר אלסטי ב חיישנים אלה נקרא TSmod והוא מורכב מרצף חוזר ונשנה של 40 חומצות אמינו, (GPGGA) 8, אשר נגזרו flagelliform חלבון משי עכביש. TSmod הוכח להתנהג כמו היענות ננו-אביב אלסטי ליניארי, עם סריג 1 עד 5 pN בכוח מתיחה 3. באורכים שונים של flagelliform יכולים לשמש כדי לשנות את r הדינמיתAnge של TSmod סריג כוח רגישות 9. בנוסף flagelliform, spectrin חוזרת 5 ו פפטיד כיסוי ראש villin (המכונה HP35) 4 שימשו כמו פפטידים אלסטי בין-זוגות סריג ב חיישנים כוח דומה 4. לבסוף, דו"ח אחרון הראה כי TSmod יכול לשמש גם כדי לזהות כוחות דחיסה 10.
אנחנו לאחרונה פיתחה חיישן כוח עבור והמקשר של-שלד התא Nucleo (LINC) חלבון מורכב Nesprin2G באמצעות TSmod מוכנס לתוך חלבון שפותחו בעבר קטועה Nesprin2G המכונה מיני-Nesprin2G (איור 2 ג), אשר מתנהג באופן דומה אנדוגניים Nesprin-2G 11. קומפלקס LINC מכיל חלבונים מרובים מפנים מבחוץ לחלק הפנימי של הגרעין, המקשר את שלד תא ציטופלסמית אל למינה הגרעיני. Nesprin-2G הוא חלבון מבני מחייב הוא אתcytoskeleton אקטין בציטופלסמה וכדי חלבונים SUN במרחב perinuclear. שימוש biosensor שלנו, הצלחנו להראות כי Nesprin-2G כפוף מתח actomyosin התלוי NIH3T3 פיברובלסטים 2. זו הייתה הפעם הראשונה בכח כי נמדד ישירות דרך חלבון במתחם LINC גרעיני, וזה עשוי להיות כלי חשוב להבין את התפקיד של כוח על הגרעין ב mechanobiology.
פרוטוקול להלן מספק מתודולוגיה מפורט של אופן השימוש בחיישן כוח Nesprin-2G, כולל את הביטוי של חיישן המתח Nesprin (Nesprin-TS) בתאי יונקים, כמו גם רכישת וניתוח של תמונות סריג של תאים המבטאים Nesprin- TS. באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך מצויד בגלאי ספקטרלי, תיאור של איך למדוד פליטה רגישה סריג באמצעות unmixing רפאי הדמית סריג ratiometric מסופקת. תמונות ratiometric הפלט ניתן להשתמש כדי להפוך קואה יחסיתהשוואות כוח ntitative. בעוד פרוטוקול זה מתמקד בביטוי של Nesprin-TS ב פיברובלסטים, זה ניתנת להתאמה בקלות לתאי יונקים אחרים, כולל שתי שורות תאים תאים ראשוניים. יתר על כן, פרוטוקול זה בכל קשור לרכישת תמונה וניתוח סריג ניתן להתאים בקלות חיישני כוח סריג מבוסס אחרים שפותחו עבור חלבונים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה והדגמה של הדמיה תא חי של מתח מכני על פני Nesprin-2G, חלבון במתחם LINC גרעיני, היה שתוארו לעיל. לפני עבודה זו, טכניקות שונות, כגון שאיפת micropipette, מגנט חרוז cytometry, ליזר-אבלציה מיקרוסקופי, שמשו ליישם עומס על גרעין התא כדי למדוד תכונות החומר בתפזורת שלה 16, <sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תומאס פ וקייט מילר Jeffress Memoria Trust (עד דצמבר) ו- NIH להעניק R35GM119617 (עד דצמבר). הדמית מיקרוסקופ confocal בוצעה לעבר Core אפיון ננו VCU (NCC) המתקן.
Materials
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35mm Dish with 20mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein,plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
- Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, 5101-5109 (2013).
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
- Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
- Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, 261-269 (2011).
- Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
- Cai, D., Chen, S. -. C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
- Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
- Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
- Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, 4099-4108 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
- Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
- Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
- Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
- Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
- Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
- Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), 956-959 (2010).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, 139-152 (2007).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).
