Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

Summary

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Abstract

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

Introduction

Sensível à força, sensores de FRET geneticamente codificados surgiram recentemente como uma ferramenta importante para a medição de forças de tracção baseada em células vivas, fornecendo informações sobre como as forças mecânicas são aplicados em proteínas ^{1, 2, 3, 4.} Com essas ferramentas, os pesquisadores podem imagem não-invasiva forças intracelulares em células vivas usando microscópios fluorescentes convencionais. Estes sensores consistem de um par de FRET (proteínas fluorescentes dadores e aceitador, mais frequentemente um dador e aceitador de azul amarela), separadas por um péptido elástica ^3. Em contraste para C- ou codificação N-terminal, este sensor está inserido num local interno de uma proteína para medir a força mecânica transmitidos através da proteína, comportando-se como um medidor de tensão molecular. O aumento da tensão mecânica entre os resultados de sensores num aumento da distância entre a FRET-par, o que resulta em diminuição de FRET ^3. Como resultado, a FRET é inversamente proporcional à força de tracção.

Estes sensores fluorescentes de base têm sido desenvolvidos para proteínas de adesão focal (vinculina ³ e talina ^4), as proteínas do citoesqueleto (α-actinina ^5), e proteínas de junção célula-célula (E-caderina ^{6, 7,} VE-caderina ^8, e PECAM ^8). O ligante elástico mais frequentemente utilizados e bem caracterizado nestes biossensores é conhecido como TSmod e consiste de uma sequência repetitiva de 40 aminoácidos, (GPGGA) _8, o qual foi derivado a partir da protea de seda de aranha flageliforme. TSmod tem sido demonstrado que se comportam como um nano-mola elástica linear, com a capacidade de resposta de FRET para 1 a 5 pN de força de tracção ^3. Diferentes comprimentos de flageliforme pode ser utilizada para alterar o r dinâmicoange de sensibilidade à força de FRET TSmod ^9. Além flageliformes, espectrina repete péptido peça de cabeça ⁵ e a vilina (conhecido como HP35) ⁴ têm sido usados como os péptidos elásticas entre pares de FRET em força biossensores semelhantes ^4. Finalmente, um relatório recente mostrou que TSmod também pode ser usado para detectar as forças de compressão ^10.

Desenvolvemos recentemente um sensor de força para o ligante da nucleo-citoesqueleto (LINC) proteína complexo Nesprin2G usando TSmod inserido numa proteína truncada Nesprin2G anteriormente desenvolvido conhecido como mini-Nesprin2G (Figura 2C), o qual se comporta de forma semelhante ao endógeno Nesprin-2G ^11. O complexo LINC contém várias proteínas que conduzem a partir do exterior para o interior do núcleo, ligando o citoesqueleto citoplasmática para a lâmina nuclear. Nesprin-2G vincula uma proteína estrutural de tanto ocitoesqueleto de actina no citoplasma e para proteínas sol no espaço perinuclear. Usando nosso biossensor, fomos capazes de mostrar que Nesprin-2G está sujeita a tensão dependente da actomiosina em NIH3T3 fibroblastos ^2. Esta foi a primeira vez que a força foi medida diretamente através de uma proteína no complexo LINC nuclear, e é provável que se torne uma ferramenta importante para compreender o papel da força no núcleo em mechanobiology.

O protocolo abaixo fornece uma metodologia detalhada de como utilizar o sensor de força Nesprin-2G, incluindo a expressão do sensor de tensão Nesprin (Nesprin-TS) em células de mamífero, bem como a aquisição e análise de imagens FRET de células que expressam Nesprin- TS. Usando um microscópio confocal invertido equipado com um detector espectral, uma descrição de como medir emissão sensibilizados FRET utilizando a separação espectral e imagiologia de FRET raciométrica é fornecido. As imagens raciométrica saída pode ser usado para fazer qua relativacomparações força ntitative. Embora este protocolo é focado sobre a expressão de Nesprin-TS em fibroblastos, é facilmente adaptável a outras células de mamíferos, incluindo ambas as linhas celulares e células primárias. Além disso, este protocolo, uma vez que refere-se a aquisição de imagem e análise de FRET pode ser facilmente adaptada para outros biossensores baseados em FRET força que têm sido desenvolvidos para outras proteínas.

Protocol

1. Obter Nesprin-2G DNA do sensor e outras DNA plasmídeo Obter Nesprin-2G TS (sensor de tensão) de controlo, Nesprin-2G HL (sem cabeça), mTFP1, Vénus, e TSmod a partir de uma fonte comercial. Propagar todos os plasmídeos de ADN e purificá-los utilizando estirpes de E. coli convencionais, tais como DH5-α, como descrito anteriormente 12, 13. 2. Células transfectar com Nesprin-2G e outro ADN de plasmídeo…

Representative Results

Seguindo o protocolo acima, o DNA de plasmídeo foi adquirida a partir do repositório de ADN e transformado em células de E. coli. E. coli que expressam o ADN do sensor foram seleccionados a partir de placas de LB / Ampicilina e amplificado em um caldo de LB líquido. Após a amplificação dos vectores, plasmídeos de ADN foram purificados em tampão TRIS-EDTA utilizando um padrão, disponíveis comercialmente kit de isolamento de ADN. Usando um espectrofotómetro, o…

Discussion

Um método e demonstração da imagem de células vivas da tensão mecânica através Nesprin-2G, uma proteína no complexo nuclear LINC, foi descrito acima. Antes deste trabalho, várias técnicas, tais como a aspiração micropipeta, magnético-grânulo citometria, e microscopia laser de ablação, têm sido usados para aplicar pressão sobre o núcleo da célula e para medir as suas propriedades de material a granel ^{16, 17, 18.</s…}

Materials

Nesprin-TS DNA	Addgene	68127	Retrieve from https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNA	Addgene	68128	Retrieve from https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNA	Addgene	54613	Retrieve from https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNA	Addgene	27793	Retrieve from https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNA	Addgene	26021	Retrieve from https://www.addgene.org/26021/
Competent Cells	Bioline	BIO-85026
Liquid LB Media	ThermoFisher	10855001	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Solid LB Bacterial Culture Plates	Sigma-Aldrich	L5667	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US
Ampicillin	Sigma	A9518
Spectrophotometer	Biorad	273 BR 07335	SmartSpec Plus
quartz cuvette	Biorad	1702504	Cuvette for SmartSpec Plus
DNA isolation kit	Macherey-Nagel	740412.5	NucleoBond Xtra Midi Plus
6-well cell culture dish	Falcon-Corning	353046	Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish
Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media	Gibco	11995-065	DMEM(1x)
Bovine Serum	Life Technologies	16170-078
reduced serum cell media	Gibco	31985-070	Reduced Serum Medium, "optimem"
Lipid Carrier Solution	invitrogen	11668-019	Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000"
1.5mL sterile plastic tube	Denville	c2170
Trypsin	Gibco	25200-056	0.25% Trypsin-EDTA (1x)
glass-bottom microscope viewing dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N	35mm Dish with 20mm Bottom Well #1.5 glass
Fibronectin	ThermoFisher	33016015	fibronectin human protein,plasma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15mL sterile centrifuge tube	Greiner bio-one	188261
swinging rotor centrifuge	Thermo electron	Centra CL2	Swinging rotor thermo electron 236
cell culture biosafety hood	Forma Scientific	1284
climate controlled cell culture incubator	ThermoFisher	3596
inverted LED widefield fluorescent microscope	Life technologies	EVOS FL
Clear HEPES buffered imaging media	Molecular Probes	A14291DJ
Fetal bovine Serum	Life technologies	10437-028
Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515nm laser sources	Zeiss	LSM 710-w/spectral META detector
Outgrowth Media	Newengland Biolabs	B9020s
NIH 3T3 Fibroblasts	ATCC	CRL-1658