Ett protokoll för användning av Förster resonansenergiöverföring (FRET) -force Biosensorer för att mäta mekaniska krafter över Nuclear LINC Complex
Summary
A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.
Abstract
The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.
Introduction
Kraft-känslig, har genetiskt kodade FRET sensorer nyligen dykt upp som ett viktigt verktyg för att mäta dragbaserade krafter i levande celler, som ger insikt i hur mekaniska krafter appliceras tvärs proteiner 1, 2, 3, 4. Med dessa verktyg, forskare kan icke-invasivt bild intracellulära krafter i levande celler med hjälp av konventionella fluorescerande mikroskop. Dessa sensorer består av ett FRET-par (donator- och acceptor fluorescerande proteiner, oftast en blå donator och gul acceptor) åtskilda av en elastisk peptid 3. I motsats till C- eller N-terminal taggning är denna sensor införd i ett inre ställe i ett protein för att mäta den mekaniska kraften som överförs över proteinet, beter sig som en molekylär töjningsgivare. Ökad mekanisk spänning över sensorn resulterar i ett ökat avstånd mellan FRET-pluft, vilket resulterar i minskade FRET 3. Som en följd av detta FRET omvänt relaterad till dragkraft.
Dessa fluorescerande baserade sensorer har utvecklats för fokala vidhäftningsproteiner (vinkulin 3 och talin 4), cytoskelettproteiner (α-actinin 5), och cell-cell-junction-proteiner (E-cadherin 6, 7, VE-cadherin 8, och PECAM 8). Den mest använda och väl känne elastisk linker i dessa biosensorer är känd som TSmod och består av en repetitiv sekvens av 40 aminosyror, (GPGGA) 8, som var härledda från spindelsilkesprotein flagelliform. TSmod har visats uppträda som en linjär elastisk nano våren, med FRET känslighet för 1 till 5 pN av dragkraft 3. Olika längder av flagelliform kan användas för att förändra den dynamiska range av TSmod FRET-force känslighet 9. Förutom flagelliform upprepar spektrin 5 och villin headpiece peptid (känd som HP35) 4 har använts som de elastiska peptiderna mellan FRET-par i liknande kraft biosensorer 4. Slutligen en färsk rapport visade att TSmod också kan användas för att upptäcka tryckkrafter 10.
Vi utvecklade nyligen en kraftsensor för linkern av nukleo-cytoskelettet (LINC) komplex protein Nesprin2G med hjälp TSmod införd i en tidigare utvecklad trunkerad Nesprin2G protein känt som mini-Nesprin2G (figur 2C), som uppför sig på liknande sätt som endogen Nesprin-2G 11. LINC-komplexet innehåller multipla proteiner som leder från utsidan till insidan av kärnan, förbinder den cytoplasmatiska cytoskelettet till den nukleära lamina. Nesprin-2G är ett strukturellt protein som binder till bådeaktin cytoskelettet i cytoplasman och SUN proteiner i perinukleära utrymmet. Med vår biosensor, kunde vi visa att Nesprin-2G är föremål för aktomyosin beroende spänningar i NIH3T3 fibroblaster 2. Detta var första gången som kraft direkt mätt över ett protein i kärn LINC komplexa, och det kommer sannolikt att bli ett viktigt verktyg för att förstå vilken roll kraft kärnan i mechanobiology.
Protokollet nedan ger en detaljerad metod för hur man använder Nesprin-2G kraftsensor, innefattande expression av Nesprin spänningssensorn (Nesprin-TS) i däggdjursceller, samt insamling och analys av FRET bilder av celler som uttrycker Nesprin- TS. Användning av ett inverterat konfokalt mikroskop utrustat med en spektral detektor, FRET en beskrivning av hur man mäter sensibiliserade emission med användning av spektral unmixing och ratiometrisk FRET avbildning tillhandahålls. Utgången ratiometrisk bilder kan användas för att göra relativa quantitative kraft jämförelser. Även om detta protokoll fokuserar på uttrycket av Nesprin-TS i fibroblaster, är det lätt att anpassa till andra däggdjursceller, inklusive både cellinjer och primära celler. Vidare kan detta protokoll eftersom det gäller bildförvärvande och FRET-analys lätt anpassas till andra FRET-baserade kraft biosensorer som har utvecklats för andra proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett förfarande och en demonstration av levande cell imaging av mekanisk spänning tvärs Nesprin-2G, ett protein i det nukleära LINC-komplexet, skisserades ovan. Före detta arbete, olika tekniker, såsom mikropipett aspiration, magnetisk-vulst-cytometri, och mikroskopisk laser-ablation, använts för att applicera belastning på cellkärnan och för att mäta dess bulkmaterialegenskaper 16, 17, 18. Emellertid, t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Thomas F. och Kate Miller Jeffress Memoria Trust (till DEC) och NIH bevilja R35GM119617 (till december). Konfokalmikroskop avbildning utfördes vid VCU Nanomaterial Karakterisering Kärna (NCC) Facility.
Materials
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35mm Dish with 20mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein,plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
- Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, 5101-5109 (2013).
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
- Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
- Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, 261-269 (2011).
- Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
- Cai, D., Chen, S. -. C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
- Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
- Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
- Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, 4099-4108 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
- Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
- Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
- Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
- Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
- Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
- Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), 956-959 (2010).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, 139-152 (2007).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).
