تحليل الكروموسومات الزيغ الناجم عن المواد-المحيط الجسيمات باستخدام<em> في المختبر</em> النظام
Summary
يصف هذا البروتوكول تقنيات القياس الكمي وتوصيف التشوهات الكروموسومية في المختبر في الضامة الماوس RAW264.7 بعد العلاج مع المحيط الجسيمات الجوية.
Abstract
التعرض لجسيمات (PM) هو مشكلة صحية عالمية رئيسية، والتي قد تؤدي إلى تلف المكونات الخلوية المختلفة، بما في ذلك المادة الوراثية النووية. لتقييم تأثير PM على سلامة الوراثية النووية، وسجل التشوهات الكروموسومية الهيكلية في هوامش الطورية من خلايا البلاعم الماوس RAW264.7. PM يتم جمعها من الهواء المحيط مع جزيئات العينات مجموعه كبيرة الحجم مع وقف التنفيذ. وبالفاعلات المواد التي تم جمعها وتصفيتها للاحتفاظ، جزء غرامة للذوبان في الماء. تتميز الجزيئات عن التركيب الكيميائي بواسطة الرنين المغناطيسي النووي (NMR) الطيفي. يتم إضافة تركيزات مختلفة من الجسيمات تعليق على ثقافة في المختبر الضامة الماوس RAW264.7 لمجموع الوقت تعرض 72 ساعة، جنبا إلى جنب مع الخلايا السيطرة غير المعالجة. في نهاية التعرض، ويتم التعامل مع الثقافة مع colcemid إلقاء القبض على خلايا في الطورية. الخلايا ثم حصادها، وتعامل مع محلول ناقص التوتر، ثابتة في acetomethanol، دropped على الشرائح الزجاجية وملطخة أخيرا مع حل بالغيمزا. يتم فحص الشرائح لتقييم الانحرافات الهيكلية الكروموسومات (CAS) في ينتشر الطورية في 1،000X التكبير باستخدام المجهر مشرق الميدان. وسجل 50-100 انتشار الطورية لكل مجموعة العلاج. ويتم تكييف هذه التقنية للكشف عن الانحرافات الهيكلية الكروموسومات (CAS)، مثل فواصل كروماتيدي من نوع، كروماتيدي من نوع التبادل، شظايا لامركزية، الكروموسومات ذو مركزين وخاتم، دقيقة مزدوجة، تنسخ داخلي، ونقل المواقع روبرتسوني في المختبر بعد التعرض للجسيمات. وهي طريقة قوية لربط نقطة نهاية الوراثية الخلوية راسخة لتعديلات جينية.
Introduction
وتشير التقديرات إلى أن التعرض لجسيمات (PM) يسبب أكثر من 3 ملايين حالة وفاة إضافية سنويا، في المقام الأول من أمراض القلب وسرطان الرئة 1. في الواقع، تم الاعتراف PM أنها مسرطنة للبشر من قبل الوكالة الدولية لبحوث السرطان (المجموعة 1)، وزيادة خطر الإصابة بسرطان الرئة مع زيادة مستويات التعرض للجسيمات وقد تبين 2. ومن المثير للاهتمام، تقريبا كل الخلايا السرطانية تؤوي شذوذ الكروموسومات العددية و / أو الهيكلية. الكربون العضوي الجسيمات هو البديل، مجمع، وخليط غير متجانس، وتركيبتها وحجم التوزيع يعتمد على الانبعاثات وكذلك التحولات الفيزيائية والكيميائية. وتمثل 35-55٪ من المناطق الحضرية PM 2.5 كتلة (PM 2.5 ميكرون في الحجم وأصغر) وأكثر من 60٪ من المناطق الريفية والقاري خلفية PM 2.5 كتلة 3، 4. حسابات الكسر للذوبان في الماء ل30-90٪ من الهباء الجوي العضوي. وهناك عدد كبير من المركبات العضويةتم التعرف عليها، بما في ذلك الهيدروكربونات الأليفاتية، والهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات، ومشتقاتها الاوكسيجين والمنترزة، والألدهيدات الأليفاتية والكحول والأحماض الدهنية الحرة وأملاحها، والأحماض دى الكربوكسيلية، والمركبات متعددة الوظائف، والبروتينات، والجزيئات الشبيهة الدبالية (HULIS) باستخدام طرق الكروماتوغرافي إلى جانب تقنيات قياس الطيف الكتلوي 5-8. وتمثل هذه المركبات أقل من 10-20٪ من الكربون العضوي الجسيمات، وبالتالي معظم الكربون العضوي غير معروف 9.
وتشير الأدلة التجريبية التي السمية الخلوية، الاكسدة، والتهاب تشارك في تطوير الحالات المرضية المرتبطة PM. وقد تبين في الآونة الأخيرة، مع ذلك، أن التعرض للجسيمات النتائج أيضا في عدد من تعديلات جينية، بما في ذلك التغيرات في الحامض النووي من العناصر المتكررة، في كل من التجريبية في أنظمة المختبر وفي المواد البشرية 10-12. ذات أهمية خاصة هي آثارمساء يوم الحمض النووي الفضائية – الأقمار الصناعية الرئيسية والثانوية – والتي توجد في المنطقة كروماتين متغاير حول السنترومير من الكروموسومات. وقد تبين أن هذه الآثار قد تكون مستمرة بطبيعتها، لأنها يمكن أن يتم الكشف عن لا يقل عن 72 ساعة بعد التعرض 12. تغيرات في الحامض النووي، وخاصة حول القسيم، قد يؤدي إلى تراكم النصوص مرنا الحمض النووي الأقمار الصناعية، وسط سلامة الكروموسومات خلال انقسام الخلايا، وبعد ذلك يؤدي إلى تطوير مجموعة متنوعة من الحالات المرضية 13.
تكييف نهج الوراثي الخلوي لتحليل المصدقة بمثابة نقطة نهاية تعديلات جينية تسبب بها مساء، وبالتالي، هو من أهمية قصوى. هنا، نحن تقرير نهج لPM جمع المحيطة والإعداد، في التعرض المختبر وتحليل المصدقة استخدام نظام بلعم نموذج RAW264.7 الفئران. تشمل الضامة خط الدفاع الأول ضد الأجسام الغريبة المستنشقة، وبالتالي، ريخدم خط زنزانته كما ثابتة والأكثر استخداما نموذج في الجسيمات وعلم السموم 11، 12، 14، 15.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتقدم الدراسة الوراثية الخلوية أو التحليل المجهري للأرقام أو هياكل الكروموسومات، في المقام الأول في هوامش الطورية، معلومات مهمة للتشخيص وتقييم المخاطر، والعلاج لمختلف الأمراض. والآن راسخة أن تشوهات الوراثية الخلوية وترتبط مع التقدم والتطور من العديد من الأمراض، ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل، في جزء منه، من المعهد الوطني للصحة مركز التميز البيولوجية بحوث [منحة عدد 1P20GM109005]، منحة اتحاد أركنساس الفضائية من خلال الوطنية للملاحة الجوية وإدارة الفضاء [عدد المنح NNX15AK32A]، والمعهد الوطني للسلامة و الصحة (NIOSH) [رقم منحة 2T420H008436]. فإن الكتاب أود أن أشكر كريستوفر Fettes لتصحيح وتحرير هذه المخطوطة.
Materials
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
References
- Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
- . . IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , (2013).
- Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
- Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
- Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
- Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
- Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
- Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
- Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
- Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
- Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
- Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , 363-392 (2005).
- Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
- Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
- Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
- Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
