L'analisi del particolato ambientale indotto aberrazioni cromosomiche L'utilizzo di un<em> In Vitro</em> sistema
Summary
Questo protocollo descrive le tecniche per la quantificazione e la caratterizzazione delle aberrazioni cromosomiche in vitro in RAW264.7 macrofagi di topo dopo il trattamento con particolato nell'aria ambiente.
Abstract
L'esposizione al particolato (PM) è una delle principali preoccupazioni di salute mondo, che può danneggiare i vari componenti cellulari, tra cui il materiale genetico nucleare. Per valutare l'impatto del PM sull'integrità genetica nucleare, aberrazioni cromosomiche strutturali sono segnati degli spread metafase dei macrofagi del mouse RAW264.7. PM è raccolto da aria ambiente con particelle campionatore ad alto volume totale sospeso. Il materiale raccolto viene solubilizzato e filtrato per mantenere la porzione fini idrosolubile. Le particelle si caratterizzano per la composizione chimica mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). Differenti concentrazioni di sospensione di particelle vengono aggiunti a una coltura in vitro di RAW264.7 macrofagi di topo per un tempo di esposizione di 72 ore, insieme con cellule di controllo non trattate. Alla fine dell'esposizione, la coltura viene trattata con Colcemid di arrestare le cellule in metafase. Le cellule vengono quindi raccolte, trattate con soluzione ipotonica, fissato acetomethanol, dropped su vetrini e infine colorate con la soluzione Giemsa. I vetrini sono esaminati per valutare le aberrazioni strutturali cromosomiche (CA) in metafase propagarsi 1,000X ingrandimento utilizzando un microscopio in campo chiaro. 50 a 100 diffusione metafase vengono assegnati per ciascun gruppo di trattamento. Questa tecnica è adatta per la rivelazione di aberrazioni strutturali cromosomiche (CA), come ad esempio le pause cromatidio-tipo, gli scambi cromatidi-tipo, frammenti acentrici, cromosomi dicentrici e ad anello, doppie minuti, endoreduplicazione, e le traslocazioni robertsoniane in vitro dopo l'esposizione a PM. Si tratta di un potente metodo per associare un endpoint citogenetica consolidata ad alterazioni epigenetiche.
Introduction
E 'stato stimato che l'esposizione al particolato (PM) fa sì che oltre 3 milioni di morti in eccesso ogni anno, soprattutto per malattie cardiopolmonari e cancro ai polmoni 1. Infatti, PM è stata riconosciuta come cancerogena per l'uomo dall'Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro (Gruppo 1), come un aumento del rischio di cancro ai polmoni con l'aumento dei livelli di esposizione al PM è stato indicato 2. È interessante notare che quasi tutte le cellule tumorali porto anomalie cromosomiche numeriche e / o strutturali. Particulate carbonio organico è una variante, complessa, e la miscela eterogenea, la cui composizione e distribuzione dimensione dipende emissioni nonché trasformazioni fisiche e chimiche. Esso rappresenta 35-55% del urbana PM 2,5 di massa (PM 2,5 micron di dimensione e più piccolo) e più del 60% del fondo rurale e continentale PM 2,5 di massa 3, 4. rappresenta la frazione solubile in acqua per 30-90% di aerosol organico. Un gran numero di composti organicisono stati identificati, compresi gli idrocarburi alifatici, idrocarburi policiclici aromatici, e loro derivati ossigenati e nitrati, aldeidi alifatici e alcoli, acidi grassi liberi e loro sali, acidi di-carbossilici, composti multifunzionali, proteine e macromolecole umiche-like (HULIS) utilizzando metodi cromatografici accoppiato con tecniche di spettrometria di massa 5-8. Questi composti rappresentano meno del 10-20% di carbonio organico particolato, quindi la maggior parte del carbonio organico è sconosciuto 9.
Prove sperimentali suggeriscono che la citotossicità, stress ossidativo, e infiammazione sono coinvolti nello sviluppo di stati patologici PM-associati. Recentemente è stato dimostrato, tuttavia, che l'esposizione a PM traduce anche in un certo numero di alterazioni epigenetiche, comprese le alterazioni nella metilazione del DNA di elementi ripetitivi, sia sperimentale sistemi in vitro ed in soggetti umani 10-12. Di particolare interesse sono gli effetti dellaPM DNA satellite – maggiori e minori satelliti – che si trovano nella regione heterochromatic attorno al centromero dei cromosomi. E 'stato dimostrato che questi effetti possono essere persistenti per natura, in quanto possono essere rilevati per almeno 72 ore dopo l'esposizione 12. Alterazioni nella metilazione del DNA, in particolare intorno centromeri, possono portare ad accumulo di trascritti di mRNA DNA satellite, l'integrità cromosomica compromesso durante la divisione cellulare e, successivamente, provocare lo sviluppo di una varietà di stati patologici 13.
Adattamento di approccio per l'analisi citogenetica di CA come end-point di alterazioni epigenetiche causati da PM, quindi, è di grande importanza. Qui, riportiamo l'approccio per il PM di raccolta e preparazione ambiente, in esposizione in vitro e analisi delle CA utilizzando il sistema murino macrofagi modello RAW264.7. I macrofagi comprendono la prima linea di difesa contro i corpi estranei inalati e, di conseguenza, tla linea cellulare serve come stabilito e il modello più utilizzato in tossicologia particelle 11, 12, 14, 15.
Protocol
Representative Results
Discussion
studio citogenetica o analisi microscopica dei numeri o strutture di cromosomi, soprattutto in spread metafase, fornisce informazioni cruciali per la prognosi, la valutazione del rischio, e il trattamento per varie malattie. E 'ormai ben stabilito che le anomalie citogenetiche sono collegati con la progressione e lo sviluppo di diverse malattie, compreso il cancro. Fino ad oggi, le CA sono stati trovati in tutti i principali tipi di tumore. CA può sorgere spontaneamente o da entrambi gli stimoli esterni o interni, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto, in parte, dal National Institute of Health Center of Biological Research Excellence [concessione numero 1P20GM109005], il Consorzio Arkansas spazio di Grant attraverso National Aeronautics and Space Administration [codice di autorizzazione NNX15AK32A], e l'Istituto nazionale per la sicurezza e la Salute (NIOSH) [codice di autorizzazione 2T420H008436]. Gli autori desiderano ringraziare Christopher Fettes per la correzione e la modifica di questo manoscritto.
Materials
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
References
- Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
- . . IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , (2013).
- Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
- Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
- Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
- Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
- Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
- Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
- Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
- Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
- Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
- Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , 363-392 (2005).
- Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
- Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
- Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
- Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
