Summary

Анализ окружающей среды твердые частицы-индуцированных хромосомных аберраций Использование номера<em> In Vitro</em> система

Published: December 21, 2016
doi:

Summary

Этот протокол описывает методы для количественной оценки и определения характеристик хромосомных аберраций в пробирке в RAW264.7 макрофагах мышей после обработки воздуха твердыми частицами окружающей среды.

Abstract

Воздействие твердых частиц (ТЧ) является одной из основных проблем здравоохранения в мире, которые могут повредить различные клеточные компоненты, в том числе ядерного генетического материала. Для того, чтобы оценить воздействие ТЧ на ядерной генетической целостности, структурные хромосомные аберрации забиты в метафазных макрофагами клеток мыши RAW264.7. PM собирается из окружающего воздуха с большим объемом общей взвешенных частиц сэмплер. Собранный материал солюбилизировали и фильтруют, чтобы сохранить водорастворимого тонкую часть. Частицы характеризуются для химического состава методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) спектроскопии. Различные концентрации суспензии частиц добавляют на в культуре в пробирке RAW264.7 макрофагов мышей в течение общего времени экспозиции 72 ч, вместе с необработанными контрольными клетками. В конце экспозиции, культура обрабатывают колцемид арестовывать клеток в метафазе. Затем клетки собирают, обрабатывают гипотонический раствор, нелетучие в acetomethanol, дropped на стеклах и, наконец, окрашивали раствором Гимза. Слайды рассматриваются для оценки структурных хромосомных аберраций (КАН) в метафазных при увеличении 1,000X с использованием светлого поля микроскопа. От 50 до 100 спрэд метафаза подсчитываются для каждой группы лечения. Этот метод адаптирован для обнаружения структурных хромосомных аберраций (ЦС), таких как разрывы хроматидный типа, обмены хроматидный типа, ацентричностью фрагменты, дицентрических и кольцевых хромосом, двойных минут, эндоредупликации и робертсоновского транслокаций в пробирке после воздействия ТЧ. Это мощный метод, чтобы ассоциировать хорошо изученного цитогенетическую конечную точку эпигенетических изменений.

Introduction

Было подсчитано , что воздействие твердых частиц (ТЧ) вызывает более 3 миллионов случаев смерти в год, в первую очередь от сердечно – сосудистых и онкологических заболеваний легких 1. Действительно, PM был признан канцерогенным для человека Международным агентством по изучению раковых заболеваний (группа 1), так как повышенный риск развития рака легких с увеличением уровня воздействия ТЧ было показано 2. Интересно, что почти все раковые клетки питают численные и / или структурные хромосомные аномалии. Твердые частицы органического углерода представляет собой вариант, сложный и гетерогенную смесь, состав которой и размер распределение зависит от выбросов, а также физических и химических превращений. На его долю приходится от 35-55% городского ТЧ 2,5 массы (ТЧ 2,5 мкм и меньше) и более 60% сельского и континентального фона ТЧ 2,5 масс 3, 4. Водорастворимая фракция составляет 30-90% органического аэрозоля. Большое количество органических соединенийбыли выявлены, в том числе алифатические углеводороды, полициклические ароматические углеводороды и их окисленные и азотированных производных, алифатических альдегидов и спиртов, свободных жирных кислот и их солей, ди-карбоновых кислот, полифункциональных соединений, белков и гуминовых макромолекул (HULIS), с использованием хроматографические методы в сочетании с масс – спектрометрических методов 5-8. Эти соединения представляют собой менее 10-20% твердых частиц органического углерода, таким образом , большая часть органического углерода, неизвестно 9.

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что цитотоксичность, окислительный стресс и воспаление вовлечены в развитие ПМ-ассоциированных патологических состояний. Недавно было показано, однако, что воздействие ТЧ приводит также к ряду эпигенетических изменений, в том числе изменения в метилирование ДНК повторяющихся элементов, как в экспериментальном в системах пробирке и у человека 10-12. Особый интерес представляют эффектыPM на сателлитной ДНК – больших и малых спутников – которые находятся в гетерохроматина области вокруг центромеры хромосом. Было показано , что эти эффекты могут быть постоянными по своей природе, так как они могут быть обнаружены в течение по крайней мере 72 ч после воздействия 12. Изменения в метилирование ДНК, особенно в районе центромеры, может привести к накоплению мРНК транскриптов сателлитной ДНК, целостность хромосомной компромиссного во время клеточного деления и, как следствие, приводит к развитию различных патологических состояний 13.

Адаптация цитогенетического подхода к анализу центров сертификации в качестве конечной точки эпигенетических изменений, вызванных ТЧ, таким образом, имеет большое значение. Здесь мы сообщаем подход для сбора ТЧ в атмосферном воздухе и подготовки, в пробирке воздействия и анализа с использованием центров сертификации мышиной макрофагальной системы RAW264.7 модели. Макрофаги составляют первую линию обороны против ингаляционных посторонних предметов и, следовательно, тего клеточная линия служит признанным и наиболее часто используемой модели в токсикологии частиц 11, 12, 14, 15.

Protocol

1. Сбор и подготовка частиц Калибровка большого объема общей взвешенных частиц пробоотборник Отключите сэмплера двигатель от контроллера массового расхода и подключить двигатель к стабильному источнику питания переменного тока (Рисунок 1). Примечание…

Representative Results

Большое внимание должно быть принято при выборе расположения ПБО пробоотборник, а также время года, когда выполняется сбор. Химический состав, а также размер частиц может существенно повлиять на результаты. Материал, собранный должен быть виден на фоне белого фильтра…

Discussion

Цитогенетические исследования или микроскопический анализ числа или структуры хромосом, в первую очередь в метафазных, предоставляет информацию решающее значение для прогнозирования, оценки риска и лечения различных заболеваний. В настоящее время точно установлено, что цитогенетич…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа была поддержана, в частности, Национальным институтом здравоохранения Центра биологических исследований передового опыта [грант номер 1P20GM109005], Арканзас космических грантов консорциума через Национальное управление по аэронавтике и исследованию космического пространства [грант номер NNX15AK32A] и Национальным институтом по охране труда и промышленной здравоохранения (NIOSH) [номер гранта 2T420H008436]. Авторы хотели бы поблагодарить Кристофера Fettes за вычитку и редактирование рукописи.

Materials

Total suspended particulate sampler Tisch Environmental TE-5170
Bruker Avance III NMR spectrometer  Bruker NA
TopSpin 3.5/pl2 software Bruker NA
ACD/NMR Processor Academic Edition ACD/Labs NA
RAW264.7 murine macrophages ATCC ATCC TIB-71
High glucose DMEM GlutaMAX media ThermoFisher 10569010 Warm in a 37°C waterbath before use
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 16000044 Warm in a 37°C waterbath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher 15140163 Warm in a 37°C waterbath before use
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher 25200056 Warm in a 37°C waterbath before use
PBS, pH 7.4 ThermoFisher 10010049 Warm in a 37°C waterbath before use
KaryoMAX Colcemid Solution in PBS ThermoFisher 15212012 Warm in a 37°C waterbath before use
KaryoMAX Potassium Chloride Solution ThermoFisher 10575090 Warm in a 37°C waterbath before use
Methanol (HPLC) Fisher Scientific A452N1-19
Acetic Acid, Glacial Fisher Scientific BP1185-500
Decon Contrad 70 Liquid Detergent Fisher Scientific 04-355-1
Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions Fisher Scientific 23-200733
Permount Mounting Medium Fisher Scientific SP15-100
Axio Imager 2 Zeiss NA

References

  1. Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
  2. . . IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , (2013).
  3. Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
  4. Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
  5. Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
  6. Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
  7. Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
  8. Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
  9. Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
  10. Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
  11. Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
  12. Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
  13. Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , 363-392 (2005).
  14. Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
  15. Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
  16. Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
  17. Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
  18. Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
  19. Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
check_url/54969?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Miousse, I. R., Koturbash, I., Chalbot, M., Hauer-Jensen, M., Kavouras, I., Pathak, R. Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System. J. Vis. Exp. (118), e54969, doi:10.3791/54969 (2016).

View Video