ניתוח של סטיות כרומוזומליות Matter הנגרמת חלקיקי אמביינט שימוש<em> במבחנה</em> מערכת
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטות כימות ואפיון של סטיות כרומוזומליות במבחנה מקרופאגים העכבר RAW264.7 לאחר הטיפול עם חומר חלקיקי באוויר הסביבה.
Abstract
חשיפה לחומר חלקיקי (PM) הוא החשש העיקרי בעולם הבריאות, אשר עשוי לגרום נזק לרכיבים תאיים שונים, לרבות החומר הגנטי גרעיני. כדי להעריך את ההשפעה של PM על שלמות גנטית גרעינית, סטיות כרומוזומליות מבניות הבקיע מתפשט metaphase של תאי מקרופאג העכבר RAW264.7. PM נאסף מאוויר הסביבה עם סמפלר חלקיקים מרחף הכולל בנפח גבוה. החומר שנאסף solubilized ומסוננים לשמור על מסיסים במים, חלק בסדר. החלקיקים מאופיינים עבור הרכב כימי על ידי ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית גרעינית (NMR). ריכוזים שונים של השעית חלקיק מתווספים על תרבות במבחנה של מקרופאגים עכבר RAW264.7 במשך זמן חשיפה כולל של 72 שעות, יחד עם לתאי קבוצת ביקורת. בסוף החשיפה, התרבות מטופלת עם colcemid לעצור תאי metaphase. תאים אז שנקטפו, שטופלו פתרון hypotonic, קבוע acetomethanol, דropped גבי שקופיות זכוכית ולבסוף מוכתם פתרון Giemsa. שקופיות נבדקות כדי להעריך את סטיות כרומוזומליות מבניות (CA) ב metaphase פורשת בהגדלה 1,000X באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. 50 עד 100 התפשטות metaphase הם הבקיע עבור כל קבוצת הטיפול. טכניקה זו מותאמת לצורך זיהוי של סטיות כרומוזומליות מבניות (CA), כגון הפסקות כרומטידה מסוג כרומטידה מהסוג חילופי, שברי acentric, כרומוזומים dicentric וטבעת, דקות כפולות, endoreduplication, ו טרנסלוקציות Robertsonian במבחנה לאחר חשיפת PM. זוהי שיטה רבת עוצמה כדי לשייך הסיום ציטוגנטית ומבוססת לשינויים אפיגנטיים.
Introduction
הערכה הוא כי חשיפה לחומר חלקיקים (PM) גורמת מעל 3 מיליון מקרי מוות מדי שנה עודפת, בעיקר ממחלות לב-ריאה וסרטן ריאות סרטן 1. ואכן, אחר הצהריים הוכר מסרטנים לבני אדם על ידי הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן (קבוצה 1), כמו סיכון מוגבר לסרטן ריאות עם העלייה ברמות החשיפה PM הוכח 2. מעניין לציין שכמעט כל תאי סרטן נמל ליקויים מספריים ו / או מבניים כרומוזומליות. פחמן אורגן חלקיקים הנו נגזר, מורכב, תערובת הטרוגנית, אשר תלוי הפצת רכב וגדל על פליטה גם לשינויים פיסיים וכימיים. זה החשבונות של 35-55% ממסת עירוני PM 2.5 (PM 2.5 מיקרומטר בגודל קטן יותר) ויותר מ 60% של PM רקע כפריים קונטיננטלית 2.5 המונית 3, 4. השבר המסיס במים מהווה 30-90% של תרסיס אורגני. מספר רב של תרכובות אורגניותזוהה, כולל פחמימנים אליפטיות, פחמימנים ארומטיים פוליציקליים, ונגזר מחומצן ו הניטריות שלהם, אלדהידים ו כהלי aliphatic, חומצות שומן חופשיות ומלחיהם, חומצות קרבוקסיליות-di, תרכובות רבות תכליתיות, חלבונים, מקרומולקולות דמוי גומין (HULIS) באמצעות שיטות chromatographic בשילוב עם טכניקות ספקטרומטריה 5-8. תרכובות אלה מהוות פחות מ 10-20% של פחמן אורגן חלקיקים, ובכך ביותר של פחמן אורגני היא 9 ידוע.
ראיה נסיונית עולה כי cytotoxicity, סטרס חמצוני, ודלקת מעורבים בהתפתחות מצבים פתולוגיים הקשורים PM. הוכח לאחרונה, עם זאת, כי חשיפת PM גם תוצאות מספר שינויים אפיגנטיים, כוללים שינויי מתילציה DNA של אלמנטים חוזרים, בשני ניסיוני במערכות במבחנה בבני אדם 10-12. מעניין במיוחד הן ההשפעות שלPM על DNA לווין – לווינים ראשיים ומשניות – אשר נמצאים באזור הטרוכרומטין ברחבי centromere של הכרומוזומים. זה היה הראה כי תופעות אלה עשויות להיות עקביות מטבעו, כפי שהם יכולים להיות מזוהים לפחות 72 שעות לאחר חשיפת 12. שינויים מתילציה DNA, במיוחד סביב צנטרומר, עלול לגרום להצטברות של תעתיקי mRNA DNA לווין, פשרה שלמות כרומוזומליות במהלך חלוקת התא, ולאחר מכן, לגרום להתפתחות של מגוון מצבים פתולוגיים 13.
התאמת הגישה ציטוגנטית לניתוח CAs כמו שינויי נקודת סיום של אפיגנטיים הנגרמים על ידי ראש הממשלה, ובכך, היא בעלת חשיבות גבוהה. כאן אנו מדווחים הגישה לאיסוף PM הסביבה והכנת, בחשיפה במבחנה וניתוח של רשויות אישורים באמצעות מערכת מודל בעכברים מקרופאג RAW264.7. המקרופאגים מהווים את קו ההגנה הראשון נגד הגופים הזרים בשאיפה, ולכן לאקו התאו משמש הקים את המודל הנפוץ ביותר ב טוקסיקולוגיה חלקיקי 11, 12, 14, 15.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר ציטוגנטית או ניתוח מיקרוסקופי של מספרים או מבנים של כרומוזומים, בעיקר מתפשט metaphase, מספק מידע חיוני עבור הפרוגנוזה, הערכת סיכונים, וטיפול במחלות שונות. עכשיו זה מבוסס היטב, כי אבנורמליות ציטוגנטית מקושרת עם ההתקדמות והתפתחות של מחלות שונות, לרבות סרטן. נכון להיום,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכה, בין השאר, על ידי המכון הלאומי של המרכז לבריאות של אקסלנס למחקר ביולוגי [מספר מענק 1P20GM109005], הקונסורציום ארקנסו שטח גרנט דרך התעופה הלאומית שטח המינהל [NNX15AK32A מספר מענק], לבין המכון הלאומי לבטיחות תעסוקתית בריאות (NIOSH) [מספר מענק 2T420H008436]. המחברים מבקשים להודות כריסטופר Fettes עבור הגהה ועריכה כתב היד הזה.
Materials
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
References
- Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
- . . IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , (2013).
- Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
- Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
- Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
- Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
- Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
- Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
- Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
- Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
- Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
- Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , 363-392 (2005).
- Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
- Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
- Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
- Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
