使用了大气颗粒物引起的染色体畸变分析<em>体外</em>系统

Summary

该协议与周围空气的微粒物质处理后描述了在RAW264.7小鼠巨噬细胞体外量化和染色体畸变的表征技术。

Abstract

暴露于颗粒物质（PM）是一个主要的全球健康问题，这可能会损坏的各种细胞组分，包括核遗传物质。为了评估PM的核遗传完整性的影响，染色体结构畸变的得分在小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的中期扩展。 PM被从环境空气中具有高体积总悬浮颗粒采样收集。所收集的材料被溶解，并过滤以保持水溶性，细部。所述颗粒的特征在于用于通过核磁共振（NMR）谱的化学组成。不同浓度的颗粒悬浮液中加入到RAW264.7小鼠巨噬细胞的体外培养72小时的总暴露时间，与未处理的对照细胞一起。在曝光结束后，文化与秋水仙胺治疗逮捕细胞分裂中期。细胞，然后收获，用低渗溶液，定格在acetomethanol，D处理ropped到玻片上，最后用吉姆萨溶液染色。幻灯片进行检查，以评估使用亮场显微镜的结构染色体畸变（CA）的分裂中期利差在放大1000倍。 50至100中期扩展被打进每个治疗组。该技术适于检测结构染色体畸变（CA）的，如染色单体型断裂，染色单体型交流，偏心片段，双着丝粒和环染色体，双分钟，核内复制，和罗伯逊易位体外暴露于PM之后的。这是一个行之有效的细胞遗传学端点后天的改变相关联的有效方法。

Introduction

据估计，暴露于颗粒物（PM）导致每年超过300万过量死亡，主要是从心肺疾病和肺癌^1。的确，PM被确认为致癌由国际癌症研究机构（组1）人类，如肺癌的暴露的水平提高到下午的风险增加已经显示^2。有趣的是，几乎所有的肿瘤细胞海港数值和/或结构染色体异常。颗粒有机碳是一种变型的，复杂的，和非均相混合物，其组成和大小分布取决于排放以及物理和化学变化。它占来自城市_的PM2.5质量的35-55％（PM 2.5微米尺寸和更小）以及农村和大陆背景的PM _2.5质量^3,4的60％以上。水溶性部分占有机气溶胶的30-90％。大量有机化合物已经确定，包括脂族烃，多环芳烃，和它们的氧化和硝化的衍生物，脂族醛和醇，游离脂肪酸和它们的盐，二羧酸，多官能的化合物，蛋白质和类腐殖质大分子（HULIS）使用色谱法加上质谱技术^5-8。这些化合物代表微粒的有机碳小于10-20％，因此大多数的有机碳是未知^9。

实验证据表明，细胞毒性，氧化应激和炎症中涉及的PM-有关的病理状态的发展。最近已显示，但是，暴露于PM也导致一些外遗传改变的，包括在重复元件的DNA甲基化的改变，在这两个实验在体外系统以及在人受试者^10-12。特别感兴趣的是的效果PM卫星DNA – 主要和次要的卫星 – 这是在围绕染色体着丝粒的异色地区发现的。结果表明，这些效果可能是由自然持久的，因为他们可以在至少72小时曝光¹²后进行检测。改变DNA甲基化，特别是围绕着丝粒，可以在细胞分裂过程导致的卫星DNA的mRNA转录物，折衷染色体完整性累积，并随后导致的各种病理状态¹³的发展。

为CA的分析所造成的PM后生改建的终点细胞遗传学方法的适应性，因此具有很高的重要性。在这里，我们报告使用小鼠巨噬细胞RAW264.7模型系统中的CA 体外照射和分析环境PM收集和准备的办法。巨噬细胞包括防御的第一线对吸入异物，因此，叔他的细胞系用作建立和粒子毒理学^{11，12，14，15}中的最常用的模型。

Protocol

1.颗粒收集和准备 高容量总悬浮微粒采样器的校准 断开质量流量控制器的采样器马达和马达连接到一个稳定的交流电源（ 图1）。 注：在此过程中不使用的过滤器。 校准器安装孔和顶部装载转接板到采样。拧紧顶部装载适配器压紧螺母牢固，以确保没有空气泄漏是否存在。允许采样马达升温到其正常的操作温度（约10-15分钟）。 覆盖与手…

Representative Results

极大，应注意在选择TSP采样器的位置，以及当进行收集一年中的时间。的化学组成，以及颗粒的尺寸可以基本上影响结果。收集的材料应该是对白色滤波器可见。普通鼠标中期扩展将有40偏心染色体。该技术的目的是要证明在异常染色体中处理的细胞与对照相比的比例的变化（或没有）。那么这种改变可以被量化（染色体异常的数量）和合格（类型异常）。 <p class="jove_…

Discussion

细胞遗传学研究或数字或染色体，主要是在中期扩展的结构，微观分析，为预测，风险评估和治疗各种疾病的关键信息。它现在公认该细胞遗传学异常与几种疾病，包括癌症的进展和发展相关。迄今为止，中国科学院已经在所有主要类型的肿瘤中发现。可诱导各种类型的细胞遗传学改变¹⁶的主要外部危险因素之一-的CA可以自发或通过外部或内部的刺激，如电离辐射（IR）的出现。 CA的辅助?…

Materials

Total suspended particulate sampler	Tisch Environmental	TE-5170
Bruker Avance III NMR spectrometer	Bruker	NA
TopSpin 3.5/pl2 software	Bruker	NA
ACD/NMR Processor Academic Edition	ACD/Labs	NA
RAW264.7 murine macrophages	ATCC	ATCC TIB-71
High glucose DMEM GlutaMAX media	ThermoFisher	10569010	Warm in a 37°C waterbath before use
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Warm in a 37°C waterbath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher	15140163	Warm in a 37°C waterbath before use
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056	Warm in a 37°C waterbath before use
PBS, pH 7.4	ThermoFisher	10010049	Warm in a 37°C waterbath before use
KaryoMAX Colcemid Solution in PBS	ThermoFisher	15212012	Warm in a 37°C waterbath before use
KaryoMAX Potassium Chloride Solution	ThermoFisher	10575090	Warm in a 37°C waterbath before use
Methanol (HPLC)	Fisher Scientific	A452N1-19
Acetic Acid, Glacial	Fisher Scientific	BP1185-500
Decon Contrad 70 Liquid Detergent	Fisher Scientific	04-355-1
Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions	Fisher Scientific	23-200733
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-100
Axio Imager 2	Zeiss	NA