Analyse af partikler i luften-induceret kromosomafvigelser Brug af en<em> In vitro</em> System

Summary

Denne protokol beskriver teknikker til kvantificering og karakterisering af kromosomafvigelser in vitro i RAW264.7 mus makrofager efter behandling med den omgivende luft partikler.

Abstract

Udsættelse for partikler (PM) er en af ​​verdens største sundhedsproblem, der kan ødelægge forskellige cellulære komponenter, herunder den nukleare genetiske materiale. For at vurdere virkningen af ​​PM om nuklear genetiske integritet, er strukturelle kromosomafvigelser scoret i de metafasespredninger af mus RAW264.7 makrofagceller. PM er indsamlet fra den omgivende luft med en samlet høj lydstyrke suspenderede partikler sampler. Det opsamlede materiale solubiliseres og filtreres til at tilbageholde den vandopløselige, fin portion. Partiklerne er kendetegnet for kemisk sammensætning ved kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Forskellige koncentrationer af partikelsuspension bliver tilføjet på en in vitro-kultur af RAW264.7 musemakrofager til en samlet eksponeringstid på 72 timer, sammen med ubehandlede kontrolceller. Ved slutningen af ​​eksponeringen, er kulturen behandlet med colcemid at anholde celler i metafase. Celler høstes dernæst, behandlet med hypotonisk opløsning, fikseret i acetomethanol, dropped på objektglas og endelig farvet med Giemsa-opløsning. Slides undersøges for at vurdere de strukturelle kromosomafvigelser (CAS) i metafase spreder på 1.000X forstørrelse ved hjælp af en lys-felt mikroskop. 50 til 100 metafasespredning scores for hver behandlingsgruppe. Denne teknik er tilpasset til detektion af strukturelle kromosomforandringer (CAS), såsom kromatidtypen-typen pauser, udveksling kromatidtypen-type, acentriske fragmenter, dicentric og ring kromosomer, dobbelt minutter, endoreduplikation og Robertsonian translokationer in vitro efter udsættelse for PM. Det er en kraftfuld metode til at knytte en veletableret cytogenetisk endpoint til epigenetiske ændringer.

Introduction

Det er blevet anslået, at eksponering for partikler (PM) forårsager over 3 millioner overskydende dødsfald årligt, primært fra hjerte-sygdomme og lungekræft ^1. Faktisk PM blev anerkendt som kræftfremkaldende for mennesker af Det Internationale Agentur for Kræftforskning (gruppe 1), en øget risiko for lungekræft med stigende eksponering for PM er blevet vist ^2. Interessant, næsten alle kræftceller havnen numeriske og / eller strukturelle kromosomafvigelser. Partikler organisk kulstof er en variant, kompleks og heterogen blanding, hvis sammensætning og størrelse fordeling afhænger af emissioner samt fysiske og kemiske omdannelser. Den tegner 35-55% af byerne PM _2,5 masse (PM 2,5 um i størrelse og mindre) og mere end 60% af baggrunden landdistrikter og kontinentale PM _2,5 masse ^{3, 4.} Den vandopløselige fraktion udgør 30-90% af organisk aerosol. Et stort antal organiske forbindelserer blevet identificeret, herunder alifatiske carbonhydrider, polycykliske aromatiske kulbrinter og deres oxygenerede og nitroderivater, alifatiske aldehyder og alkoholer, frie fedtsyrer og deres salte, dicarboxylsyrer, multifunktionelle forbindelser, proteiner og humus-lignende makromolekyler (HULIS) under anvendelse kromatografiske metoder kombineret med massespektrometrisk teknikker ^5-8. Disse forbindelser udgør mindre end 10-20% af partikulært organisk kulstof, og dermed de fleste af organisk kulstof er ukendt ^9.

Eksperimentelle beviser antyder, at cytotoksicitet, oxidativt stress og inflammation er involveret i udviklingen af ​​PM-associerede patologiske tilstande. Det har for nylig vist, dog, at eksponering for PM resulterer også i en række epigenetiske ændringer, herunder ændringer i DNA-methylering af repetitive elementer, i både eksperimentelle in vitro systemer og i humane individer ^10-12. Af særlig interesse er virkningerne afPM på satellit-DNA – større og mindre satellitter – som findes i heterochromatic regionen omkring centromeren af ​​kromosomer. Det blev vist, at disse virkninger kan være persistente af natur, da de kan påvises i mindst 72 timer efter eksponering ^12. Ændringer i DNA-methylering, især omkring centromerer, kan føre til akkumulering af satellit-DNA-mRNA-transkripter, kompromis kromosomale integritet under celledeling og efterfølgende resultere i udvikling af en række forskellige patologiske tilstande ^13.

Tilpasning af cytogenetisk fremgangsmåde til analyse af CA'er som et endepunkt af epigenetiske ændringer forårsaget af PM, således er af stor betydning. Her rapporterer vi tilgangen til den omgivende PM indsamling og forberedelse, in vitro eksponering og analyse af CA'er hjælp af murine makrofag RAW264.7 model system. Makrofager omfatter den første linje i forsvar mod de inhalerede fremmedlegemer og dermed thans cellelinie tjener som en etableret og de hyppigst anvendte model i partikel toksikologi ^{11, 12, 14, 15.}

Protocol

1. Particle Indsamling og klargøring Kalibrering af den samlede høj lydstyrke suspenderede partikler sampler Afbryd sampler motor fra massestrømsstyreenheden og forbinde motoren til en stabil vekselstrømskilde (figur 1). BEMÆRK: bruges ikke Et filter under denne procedure. Monter kalibrator blænde og top loading adapterplade til sampler. Stram de øverste lastning adapter hold-down nødder sikkert til sikre, at ingen utætheder er til stede. Ti…

Representative Results

Stor omhu bør tages i at vælge placeringen af ​​TSP sampler, samt den tid af året, hvor kollektionen er udført. Den kemiske sammensætning samt størrelsen af ​​partikler kan i det væsentlige påvirke resultatet. Det indsamlede materiale skal være synlig mod den hvide filter. En normal mus metafase spredning vil have 40 acentriske kromosomer. Målet med den teknik er at påvise en ændring (eller fravær deraf) i andelen af ​​unormale kromosomer i behandlede celler i fo…

Discussion

Cytogenetisk undersøgelse eller mikroskopisk analyse af tal eller strukturer af kromosomer, primært i metafase spreads, giver oplysninger afgørende for prognose, risikovurdering, og behandling af forskellige sygdomme. Det er nu veletableret, at cytogenetiske abnormaliteter er forbundet med progression og udviklingen af ​​flere sygdomme, herunder cancer. Til dato har CA'er blevet fundet i alle større tumortyper. CA'er kan opstå spontant eller ved enten eksterne eller interne stimuli, såsom ioniserende s…

Materials

Total suspended particulate sampler	Tisch Environmental	TE-5170
Bruker Avance III NMR spectrometer	Bruker	NA
TopSpin 3.5/pl2 software	Bruker	NA
ACD/NMR Processor Academic Edition	ACD/Labs	NA
RAW264.7 murine macrophages	ATCC	ATCC TIB-71
High glucose DMEM GlutaMAX media	ThermoFisher	10569010	Warm in a 37°C waterbath before use
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Warm in a 37°C waterbath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher	15140163	Warm in a 37°C waterbath before use
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056	Warm in a 37°C waterbath before use
PBS, pH 7.4	ThermoFisher	10010049	Warm in a 37°C waterbath before use
KaryoMAX Colcemid Solution in PBS	ThermoFisher	15212012	Warm in a 37°C waterbath before use
KaryoMAX Potassium Chloride Solution	ThermoFisher	10575090	Warm in a 37°C waterbath before use
Methanol (HPLC)	Fisher Scientific	A452N1-19
Acetic Acid, Glacial	Fisher Scientific	BP1185-500
Decon Contrad 70 Liquid Detergent	Fisher Scientific	04-355-1
Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions	Fisher Scientific	23-200733
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-100
Axio Imager 2	Zeiss	NA