Fosforo-31 spettroscopia di risonanza magnetica: uno strumento per misurare<em> In Vivo</em> Capacità fosforilazione ossidativa mitocondriale nel muscolo scheletrico umano

Summary

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (³¹PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Abstract

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (³¹PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo ³¹PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. ³¹PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for ³¹PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Introduction

L'obiettivo di questo lavoro è quello di delineare un metodo riproducibile per misurare in modo non invasivo in vivo funzione mitocondriale nel muscolo scheletrico in persone fisiche che hanno una vasta gamma di abilità. insufficienza mitocondriale aberrante è un segno distintivo di una vasta gamma di sindromi metaboliche e le malattie genetiche, dalle condizioni comuni come l'invecchiamento e il diabete di malattie rare come l'atassia di Friedreich.

Sindrome metabolica e disfunzione mitocondriale

La sindrome metabolica è stato indicato per interrompere la funzione mitocondriale, deprimere scheletrico OXPHOS muscolare, e portare a stoccaggio dei lipidi ectopica nel muscolo scheletrico ^{1, 2.} Organelli come critici che regolano metabolismo e l'omeostasi energetica, i mitocondri sono implicati nella fisiopatologia dell'obesità ^{3, 4, 5} insulino-resistenza </sup>, Diabete di tipo 2 (DM2) ^{6, 7,} correlata al diabete micro ^{8, 9, 10, 11} e complicanze macrovascolari ^{12, 13,} e non alcoliche malattia del fegato grasso (NAFLD) ^{14, 15, 16,} tra gli altri, .Insulin resistenza è caratterizzato da profondi cambiamenti nel muscolo scheletrico attività mitocondriale, tra cui diminuito mitocondriale degli acidi tricarbossilici (TCA) tasso di flusso, il tasso di sintesi di ATP e citrato sintasi e NADH: O ₂ attività ossidoreduttasi ^5. Una ipotesi è che queste alterazioni potrebbero essere dovute all'accumulo di acidi grassi liberi (FFA) metaboliti nel muscolo, che vengono notevolmente aumentata durante l'obesità e altri obesità-rmalattie euforico ^{2, 17.} L'esposizione del muscolo FFAs elevati e intermedi lipidici può diminuire l'espressione di geni nella via ossidativa dei lipidi e il ciclo TCA e catena di trasporto degli elettroni (ETC) ^18. Questa riduzione mitocondriale scheletrico capacità OXPHOS muscolare nella cornice di un sovraccarico di lipidi è accompagnata da una diminuzione del (contenuto e la biogenesi dei mitocondri) quantitativa ¹⁹ e la funzione qualitativa dei mitocondri dei muscoli scheletrici ^20. Esponendo muscolo scheletrico e miociti a FFAs porta a grave resistenza all'insulina, e una maggiore assorbimento di FFA nel muscolo è associata alla resistenza all'insulina in entrambi gli esseri umani e roditori ^21. Il intermedi lipidici ceramide e diacilglicerolo (DAG) hanno dimostrato di inibire direttamente la via di segnalazione dell'insulina alterando l'attività di chinasi, come la proteina chinasi C e protein chinasi B ^21. Pertanto, molecole lipidiche di derivazione sembrano svolgere un ruolo di primo piano nello sviluppo della scheletrico insulino-resistenza muscolare e diabete di tipo 2. Tuttavia, non è chiaro se i cambiamenti nella capacità mitocondriale sono una causa o una conseguenza di insulino-resistenza ^22.

Atassia e mitocondriale disfunzione di Friedrich

OXPHOS Diminuzione possono anche derivare da difetti genetici. L'atassia di Friedrich (FA), la forma più comune di atassia ereditaria, è una malattia genetica causata da una mutazione nel fratassina (FXN) gene, con conseguente accumulo di ferro intra-mitocondriale, la produzione di specie reattive dell'ossigeno, e anomalie della fosforilazione ossidativa ^{23, 24, 25, 26.} Questa importante scoperta ha portato allo sviluppo di terapie mirate, which obiettivo di migliorare la funzione mitocondriale a livello sub-cellulare. Nonostante questa comprensione, vi è stato limitato sviluppo in vivo, biomarcatori riproducibili per la ricerca clinica FA. In realtà, una barriera critica nella valutazione efficace delle terapie mirate in FA è l'incapacità di tenere traccia delle modifiche in funzione mitocondriale. misure funzionali attuali, per esempio, può identificare diminuzione della gittata cardiaca; tuttavia, sono incapaci di determinare il livello a cui avviene il erettile (Figura 1). Lo sviluppo di un indicatore affidabile della funzione mitocondriale che può essere utilizzato per identificare e valutare la progressione della malattia in atassia di Friedrich è fondamentale per valutare il relativo impatto meccanicistica di terapie mirate.

OXPHOS deteriorate e disfunzione cardiaca

Aberrant funzione mitocondriale, sia acquisita o genetica, potrebbe contribuire allo sviluppo o la progressione di cardiLa disfunzione ac. Nelle condizioni di sovraccarico di pressione e di insufficienza cardiaca, l'energia primaria passa substrato di preferenza da FFA al glucosio. Questo è associato con diminuzione dell'attività ETC e fosforilazione ossidativa ^27. La fisiopatologia della bioenergetica mitocondriale nella disfunzione cardiaca può essere diverso a seconda della provenienza primaria del difetto mitocondriale. Diabete e sindrome metabolica risultati in alterazioni mitocondriali nel miocardio, come la biogenesi compromessa e il metabolismo degli acidi grassi, che portano ad una ridotta flessibilità del substrato, l'efficienza energetica, e alla fine, la disfunzione diastolica ^{28, 29.} In FA, invece, una carenza frataxin risultati in significativo accumulo di ferro mitocondriale in cardiomiociti ^{30, 31.} Accumulo di ferro porta alla produzione di radicali liberi tramite la reazione di Fenton ^{32 <}/ Sup> e aumenta la possibilità di danni dei radicali liberi indotti cardiomiociti. L'accumulo di ferro intra-mitocondriale è anche associata ad una maggiore sensibilità allo stress ossidativo e una ridotta capacità ossidativa ^{30, 31.} L'accumulo di ferro e la successiva funzione mitocondriale aberranti, a causa della carenza di fratassina, possono quindi essere responsabile per l'energetica cardiaca compromessa e cardiomiopatia osservati in FA ^{33, 34.} E 'anche interessante notare che la capacità ossidativa ridotta nei mitocondri dei muscoli scheletrici parallela alla intolleranza esercizio e ridotta capacità metabolica nello scompenso cardiaco (HF) ^35. Misurazione della scheletrico capacità OXPHOS muscolare, come specificato nel presente documento, è facilmente implementabile e robusto; accoppiato con il significato di OXPHOS muscolo scheletrico in HF, queste caratteristiche lo rendono un biomarker attraente in studi completi di sentiret malattia ^36.

OXPHOS deteriorate e la disfunzione cardiaca di accompagnamento non è un aspetto irrilevante di metabolica e malattia mitocondriale. I soggetti con diabete e malattie metaboliche sono a più alto rischio di sviluppare malattie cardiovascolari e hanno eccesso di mortalità dopo infarto miocardico (MI) ^{37, 38, 39, 40, 41;} oltre la metà dei soggetti FA avere cardiomiopatia, e molti muoiono di aritmia cardiaca o insufficienza cardiaca ^42. Pertanto, la quantificazione della riduzione OXPHOS potrebbe non solo permettere la diagnosi precoce e il trattamento della disfunzione cardiaca, ma potrebbe anche alleviare un grande onere clinica in queste malattie.

terapie mirate per aumentare direttamente la capacità OXPHOS è un settore promettente per migliorare il trattamento di soggetti, whether la causa della disfunzione metabolica è genetica o acquisita. Attualmente, lo sviluppo di nuovi farmaci che alleviano o anormale funzione mitocondriale ⁴³ o correggere il difetto genetico primario ⁴⁴ in grado di migliorare la bioenergetica caratteristica squilibrato di FA mirati. Nel caso di disfunzione mitocondriale acquisita, aumento dell'attività fisica può migliorare la funzione mitocondriale ^{45, 46, 47.}

³¹ Fosforo spettroscopia di risonanza magnetica come biomarcatore non invasivo della funzione mitocondriale

Indipendentemente dalla terapia testata, un integrato nella valutazione vivo di bioenergetica del muscolo scheletrico è uno strumento fondamentale per valutare l'impatto degli interventi mirati, soprattutto nei soggetti con grave intolleranza esercizio fisico o l'incapacità di subire metabo convenzionaletest lic. Spettroscopia di risonanza magnetica sintonizzato fosforo ⁽³¹ PMRS), un nucleo endogena trovato in vari substrati ad alta energia all'interno delle cellule in tutto il corpo, è stato utilizzato per quantificare la capacità ossidativa mitocondriale utilizzando una varietà di approcci, compreso a magnete protocolli esercizio recupero e stimolazione muscolare protocolli ^48. I protocolli esercizio di recupero si basano su una serie di apparecchi che vanno in complessità da ergometri compatibili con la risonanza magnetica che regolano e misurano il carico di lavoro per semplici configurazioni di cinghie e tamponi che consentono di scoppio di tipo resistivo e l'esercizio fisico quasi-statico. Uno degli obiettivi primari di qualsiasi di questi protocolli è quello di produrre uno squilibrio energetico per il quale la domanda di adenosina trifosfato (ATP) viene inizialmente soddisfatta attraverso la ripartizione enzimatica di fosfocreatina (PCR) attraverso la creatina chinasi reazione ^49. Al momento della cessazione di esercizio, il tasso di produzione di ATP è dominata da pho ossidativosphorylation e rappresenta la massima capacità vivo dei mitocondri ^50. Inoltre, OXPHOS durante il recupero post-esercizio può essere descritto da una reazione di primo ordine ^51. Il recupero post-esercizio della PCR può quindi essere quantificata dal montaggio di una costante di tempo esponenziale (τ _PCR), con i valori più bassi di τ _PCr che rappresentano una maggiore capacità di sintesi di ATP ossidativo. Notevoli sforzi sono stati fatti per validare ³¹ PMRS contro ex vivo e misure più dirette di OXPHOS e dimostrare il potenziale applicabilità clinica di questa tecnica ^{52, 53, 54, 55.}

In particolare, il protocollo descritto in questo lavoro può essere implementato su scanner clinicamente disponibili, ed è stato ampiamente validato quale non invasivo biomarker of funzione mitocondriale ^56. Tuttavia, un esercizio di ³¹ protocollo PMRS ottimizzato per l'applicazione alle persone con diversi livelli di gravità della compromissione neuromuscolare o di mobilità non è stato ben definito ^57. A ben definito, in generale, applicabile protocollo di esercizio e ^{il 31} la tecnica PMRS sarebbero particolarmente utili nella valutazione delle patologie con anomalie fondamentali nella funzione mitocondriale.

Diversi studi precedenti hanno esplorato le applicazioni di tecniche non invasive per quantificare la funzione mitocondriale nei soggetti. Per esempio, queste tecniche hanno dimostrato OXPHOS ridotta nei soggetti con diabete di tipo 2 ^36. Lodi et al. prima testato la fattibilità di tecniche PMRS in soggetti con FA ed ha trovato che 1) il difetto genetico fondamentale nella FA danneggia scheletrico OXPHOS muscolare e 2) il numero di GAA tripletta ripetizioni è inversamente proporzionale al muscolo scheletrico OXPHOS ^33. Più recentemente, Nachbauer et al. PMRS usato come misura di esito secondario in un trial clinico di FA con 7 soggetti. I tempi di recupero PCR sono stati significativamente più lungo nei soggetti rispetto ai controlli, riaffermando precedente lavoro di Lodi e che indica che gli effetti di espressione frataxina aberrante in FA possono causare una diminuzione della capacità mitocondriale che è rilevabile con tecniche PMRS ^58.

Metodi affidabili per definire in modo adeguato in vivo funzione del muscolo scheletrico in un rapporto costo-efficacia, e modo riproducibile fattibile sono fondamentali per migliorare i risultati soggetti a una serie di malattie che colpiscono la funzione mitocondriale.

Questo lavoro delinea una procedura affidabile per ottenere in vivo massima capacità ossidativa del muscolo scheletrico con ³¹ PMRS. Il protocollo di esercizio in-magnete è ben tollerato da individui che coprono una vasta gamma di fisica e functionaL capacità e offre una messa a punto soggetto semplificata utilizzando attrezzature poco costoso e ampiamente disponibili.

Protocol

Questo protocollo è approvato dalla e segue le linee guida della Institutional Review Board Ohio State University per la sperimentazione umana. E 'estremamente importante che tutte le procedure che coinvolgono attrezzature MR vengono eseguite da personale adeguatamente addestrato che aderiscono ai più alti standard di sicurezza MR 59. 1. Materiali e preparazione Assicurarsi che tutti i materiali necessari sono disponibili prima dell'esperim…

Representative Results

La riproducibilità di studio Sei volontari (4 uomini e 2 donne, età media: 24,5 ± 6,2 anni) con nessun cuore auto-riportati, metabolica o malattia mitocondriale sono stati sottoposti a sessioni di esercizio e di imaging tecnica 31 PMRS descritto a 2 giorni diversi entro 1 settimana per valutare la tecnica riproducibilità (Figura 6a). Gli studi condotti su volontari sani conferma…

Discussion

Questo documento descrive un protocollo standard per l'esame ³¹ PMRS che permette la misurazione di serie e non invasiva in vivo del muscolo scheletrico funzione mitocondriale. Il protocollo tiene notevole appeal quando si considera l'ampiezza delle indagini rivolte al crescente peso della sindrome metabolica e la sua morbilità e mortalità che ne deriva. Questo protocollo ³¹ PMRS richiede una quantità minima di tempo scanner e può essere incorporato in indagini metaboliche glob…

Materials

1.5 T MR Scanner	Siemens		manufacturer will not affect results
10 cm 31P transmit-receive coil, 1.5T compatible	PulseTeq		manufacturer will not affect results
3 fl oz Baby Oil	Johnson & Johnson		manufacturer will not affect results
Foam triangle cushion (Knee)	Siemens		manufacturer will not affect results
(3) plastic buckle resistive straps; table to table	Siemens		manufacturer will not affect results
(1) plastic buckle resistive strap; self-connecting	Siemens