Fosfor-31 Magnetic Resonance spektroskopi: Et verktøy for måling<em> I Vivo</em> Mitokondriell oksidativ fosforylering Kapasitet i Human Skeletal Muscle

Summary

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (³¹PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Abstract

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (³¹PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo ³¹PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. ³¹PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for ³¹PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Introduction

Målet med dette arbeidet er å skissere en reproduserbar metode for å invasivt måle in vivo skjelettmuskulatur mitokondrienes funksjon hos personer som innehar et bredt spekter av evner. Avvikende mitokondriefunksjon er et kjennetegn på et bredt spekter av metabolske syndromer og genetiske sykdommer, fra vanlige forhold som aldring og diabetes til sjeldne lidelser som Friedreichs ataksi.

Metabolsk syndrom og mitokondriell dysfunksjon

Metabolsk syndrom har vist seg å forstyrre mitokondriefunksjon, trykk skjelettmuskel OXPHOS, og føre til ektopisk lipid lagring i skjelettmuskel ^{1, 2.} Som kritiske organeller som regulerer metabolske og energihomeostase, blir mitokondrier implisert i patofysiologien til fedme ^{3, 4, 5} insulinresistens </sup>, Type 2 diabetes mellitus (diabetes mellitus type 2) ^{6, 7,} diabetes-relaterte mikro- ^{8, 9, 10, 11} og makrovaskulære komplikasjoner ^{12, 13,} og ikke-alkoholisk fettleversykdom (NAFLD) ^{14, 15, 16,} bl.a. .Insulin motstand er preget av dyptgripende endringer i skjelettmuskulatur mitokondrienes aktivitet, inkludert redusert mitokondrie trikaboksylsyre (TCA) fluks rate, ATP syntese rate, og citratsyntaseaktivitet og NADH: O ₂ oksidoreduktase aktivitet ^fem. En hypotese er at disse endringer kan skyldes opphopning av frie fettsyrer (FFA) metabolitter i muskelen som er markert øket i løpet av fedme og andre fedme-ropprømt sykdommer ^{2, 17.} Eksponering av muskelen til forhøyede FFA og lipid-mellomprodukter kan redusere ekspresjonen av gener i lipid oksidative reaksjonsveien, så vel som den TCA syklus og elektrontransportkjeden (ETC) ^18. Denne reduksjonen i mitokondrie skjelettmuskulatur OXPHOS kapasitet i innstillingen av en lipid overbelastning er ledsaget av en nedgang i den kvantitative (innhold og biogenesis av mitokondrier) ¹⁹ og kvalitativ funksjon av skjelettmuskulatur mitokondrier ^20. Eksponere skjelettmuskulatur og myocytter til FFA'er fører til alvorlige insulinresistens og økt FFA opptak i muskelen er assosiert med insulinresistens hos både mennesker og gnagere ^21. Den lipid mellomprodukter ceramid og diacylglycerol (DAG), har blitt vist å direkte inhibere insulinsignalveien ved å endre aktiviteten av kinaser, for eksempel proteinkinase C og protein kinase B ^21. Derfor lipid-avledede molekyler ser ut til å spille en viktig rolle i utviklingen av skjelettmuskulatur insulinresistens og diabetes mellitus type 2. Imidlertid er det fortsatt uklart om endringer i mitokondrie kapasitet er en årsak eller en konsekvens av insulinresistens ^22.

Friedrich ataksi og mitokondriell dysfunksjon

Redusert OXPHOS kan også oppstå fra genetiske defekter. Friedrichs ataksi (FA), den mest vanlige formen for arvelig ataksi, er en genetisk lidelse forårsaket av en mutasjon i frataxin (FXN) genet, som resulterer i intra-mitokondriell jernakkumulering, reaktive oksygenarter produksjon, og forandringer av oksidativ fosforylering ^{23, 24, 25, 26.} Denne viktige oppdagelsen har ført til utviklingen av målrettet terapi, hh formål å forbedre mitokondriefunksjon på sub-cellenivå. Til tross for denne forståelsen, har det vært begrenset utvikling av in vivo, reproduserbare biomarkører for FA klinisk forskning. Faktisk er en kritisk barriere i effektiv evaluering av målrettet terapi i FA manglende evne til å spore endringer i mitokondrienes funksjon. Nåværende funksjonelle tiltak, for eksempel kan identifisere nedsatt minuttvolum; men de er ikke i stand til å bestemme nivået ved hvilket dysfunksjon oppstår (figur 1). Utviklingen av en pålitelig markør for mitokondriell funksjon som kan brukes til å identifisere og evaluere sykdomsprogresjon i Friedrichs ataksi er avgjørende for å måle den aktuelle mekanistiske virkningen av målrettede terapier.

Nedsatt OXPHOS og hjertefunksjon

Avvikende mitokondriefunksjon, enten ervervet eller genetisk, kan bidra til utvikling eller progresjon av cardiac dysfunksjon. Under betingelsene for trykk overbelastning og hjertesvikt, til den primære energi substrat innstillingsbryter fra FFA glukose. Dette er forbundet med redusert ETC aktivitet og oksidativ fosforylering ^27. Patofysiologien av mitokondrie bioenergi i hjertefunksjon kan være forskjellig avhengig av den primære opprinnelsen til mitokondrie defekt. Diabetes og metabolske syndrom resultater i mitokondrie forandringer i hjertemuskelen, slik som svekket biogenesis og fettsyremetabolisme, noe som fører til redusert substrat fleksibilitet, energieffektivitet, og til slutt, diastolisk dysfunksjon ^{28, 29.} I FA, på den annen side, en frataxin mangel resulterer i betydelig mitokondriell jern-akkumulering i kardiomyocytter ^{30, 31.} Jern opphopning fører til produksjon av frie radikaler via Fenton reaksjonen ^{32 <}/ Sup> og øker sjansen for fri radikal-indusert kardiomyocytt skade. Intra-mitokondriell jernakkumulering er også forbundet med en økt følsomhet for oksidativt stress og en redusert oksidativ kapasitet ^{30, 31.} Iron akkumulering og påfølgende avvikende mitokondriefunksjon, på grunn av frataxin mangel, kan derfor være ansvarlig for nedsatt hjerte energetikk og kardiomyopati observert i FA ^{33, 34.} Det er også interessant å merke seg at den reduserte oksidative kapasiteten i skjelettmuskel mitokondriene paralleller øvelsen intoleranse og redusert metabolsk kapasitet i hjertesvikt (HF) ^35. Måling av skjelettmuskulatur OXPHOS kapasitet, som beskrevet her, er lett gjennomførbar og robust; kombinert med betydningen av skjelettmuskulatur OXPHOS i HF, disse funksjonene gjør det til et attraktivt biomarkør i omfattende studier av høret sykdom ^36.

Nedsatt OXPHOS og den tilhørende hjertefunksjon er ikke en ubetydelig del av metabolske og mitokondrie sykdom. Individer med diabetes og metabolsk sykdom er på et høyere risiko for å utvikle hjerte- og karsykdommer og har overdødelighet etter hjerteinfarkt (MI) ^{37, 38, 39, 40, 41;} over halvparten av FA fag har kardiomyopati, og mange dør av hjertearytmi eller hjertesvikt ^42. Derfor kvantifisering av redusert OXPHOS kan ikke bare tillate for tidlig oppdagelse og behandling av hjerteproblemer, men det kan også lindre en stor klinisk byrde på disse sykdommene.

Målrettet terapi for å direkte øke OXPHOS kapasitet er et lovende område for å forbedre behandlingen av fag, whether årsaken til metabolsk dysfunksjon er genetisk eller ervervet. Foreløpig utviklingen av romanen målrettede medikamenter som enten lindre unormal mitokondriefunksjon ⁴³ eller korrigere den primære genetiske defekten ⁴⁴ kan forbedre sinnsforvirret bioenergi karakteristisk for FA. I tilfelle av ervervet mitokondriell dysfunksjon, kan øket fysisk aktivitet forbedre mitokondriefunksjon ^{45, 46, 47.}

³¹ Fosfor Magnetic Resonance spektroskopi som en ikke-invasiv Biomarker av mitokondriefunksjon

Uavhengig av testet terapi, en integrert in vivo vurdering av skjelettmuskel bioenergi er et viktig verktøy for å vurdere effekten av målrettede tiltak, særlig hos personer med alvorlig mosjon intoleranse eller manglende evne til å gjennomgå vanlig metabolic testing. Magnetisk resonans spektroskopi innstilt til fosfor ⁽³¹ PMRS), et endogent kjerne funnet i ulike høy-energi underlag i celler i hele kroppen, har blitt brukt til å kvantifisere mitokondriell oksidativ kapasitet ved hjelp av en rekke tilnærminger, inkludert in-magnet øvelse-utvinning protokoller og muskelstimulering protokoller ^48. Øvelsen-utvinning protokoller stole på en rekke apparater som varierer i kompleksitet fra MR-kompatible ergometer som regulerer og måler arbeidsmengden til enkle konfigurasjoner av stropper og pads som åpner for burst-type resistive og kvasi-statisk trening. Ett av de primære mål i en hvilken som helst av disse protokollene er å frembringe en energiubalanse for hvilke behovet for adenosin trifosfat (ATP) til å begynne med dekket gjennom enzymatisk nedbrytning av fosfokreatin (PCr) gjennom kreatinkinase reaksjons ^49. Ved opphør av trening, er frekvensen av ATP produksjonen dominert av oksidativt phosphorylation og representerer den maksimale kapasitet in vivo av mitokondriene ^50. Videre kan OXPHOS under etter øvelsen utvinning beskrives med en første-ordens hastighet reaksjon ^51. Den etter øvelsen utvinning av PCR kan derfor kvantifiseres ved montering av en eksponensiell tidskonstant (τ _PCR), med mindre verdier av τ _PCr representerer større kapasitet for oksidativt ATP syntese. Betydelig innsats har blitt gjort for å validere ³¹ PMRS mot ex vivo og mer direkte tiltak av OXPHOS og demonstrere potensialet klinisk anvendelse av denne teknikken ^{52, 53, 54, 55.}

Spesielt, kan protokollen som er beskrevet i dette arbeidet implementeres på klinisk tilgjengelige skannere, og det har vært mye validert som en ikke-invasiv biomarkør of mitokondrienes funksjon ^56. Men en øvelse ³¹ PMRS protokoll optimalisert for søknad til personer med varierende alvorlighetsgrad av nevromuskulær svekkelse eller mobilitet har ikke blitt godt etablert ^57. En veldefinert, bredt anvendelig-mosjonsprotokoll og ³¹ PMRS teknikk ville være spesielt nyttig ved evalueringen av sykdommer med fundamentale unormalt i mitokondriefunksjonen.

Flere tidligere studier har utforsket anvendelser av ikke-invasive teknikker for å kvantifisere mitokondrienes funksjon i fag. For eksempel har disse teknikkene vist svekket OXPHOS hos personer med type 2 diabetes ^36. Lodi et al. først ble muligheten av å PMRS teknikker hos individer med FA og fant at 1) den grunnleggende genetisk defekt i FA svekker skjelettmuskel OXPHOS og 2) antallet GAA lett gjentar er omvendt proporsjonal med skjelettmuskel OXPHOS ^33. I den senere tid Nachbauer et al. brukte PMRS som et sekundært effektmål i en FA narkotika studie med 7 fag. PCR utvinning ganger var signifikant lenger i fag sammenlignet med kontroller, bekrefter Lodi tidligere arbeider, og indikerer at effekten av avvikende frataxin uttrykk i FA kan resultere i en nedgang i mitokondrie kapasitet som kan påvises ved hjelp av PMRS teknikker ^58.

Pålitelige metoder for å definere tilstrekkelig in vivo skjelettmuskelfunksjon i et gjennomførbart, kostnadseffektiv, og reproduserbar måte er avgjørende for å forbedre lagt resultater i en rekke sykdommer som påvirker mitokondriefunksjonen.

Dette arbeidet skisserer en robust prosedyre for å få in vivo maksimal oksidativ kapasitet på skjelettmuskulatur ved hjelp av ³¹ PMRS. Den in-magnet øvelsen protokollen er godt tolerert av personer som spenner over et bredt spekter av fysiske og funksjonellel evner og gir en forenklet emne oppsett ved hjelp av billig og allment tilgjengelig utstyr.

Protocol

Denne protokollen er godkjent av og følger retningslinjene fra Ohio State University Institutional Review Board for mennesker forskning. Det er kritisk viktig at alle prosedyrer som involverer MR utstyr utføres av tilstrekkelig opplært personell følger de høyeste standarder for MR sikkerhet 59. 1. Materialer og klargjøring Sørg for at alle nødvendige materialer er tilgjengelige før forsøket (figur 2). Plugg 3…

Representative Results

reproduserbarhetsstudie Seks frivillige (4 menn og 2 kvinner, gjennomsnittsalder: 24,5 ± 6,2 år) med ingen selvrapportert hjerte, metabolske, eller mitokondriell sykdom gikk økter av den beskrevne 31 PMRS trening og avbildningsteknikk på 2 ulike dager i løpet av en uke til å vurdere teknikk reproduserbarhet (figur 6a). Funksjonene som utføres på normale frivillige studier be…

Discussion

Dette notatet beskriver en standardprotokoll for ³¹ PMRS eksamen som gir serie og ikke-invasiv måling av skjelettmuskulatur mitokondrienes funksjon in vivo. Protokollen inneholder betydelig appell når de vurderer bredden i undersøkelser rettet mot den voksende byrden av metabolsk syndrom og dets resulterende sykelighet og dødelighet. Denne ³¹ PMRS protokollen krever en minimal mengde skanner tid, og kan bli innlemmet i omfattende metabolske undersøkelser hos individer som helst senter…

Materials

1.5 T MR Scanner	Siemens		manufacturer will not affect results
10 cm 31P transmit-receive coil, 1.5T compatible	PulseTeq		manufacturer will not affect results
3 fl oz Baby Oil	Johnson & Johnson		manufacturer will not affect results
Foam triangle cushion (Knee)	Siemens		manufacturer will not affect results
(3) plastic buckle resistive straps; table to table	Siemens		manufacturer will not affect results
(1) plastic buckle resistive strap; self-connecting	Siemens