Fosfor-31-magnetisk resonansspektroskopi: ett verktyg för att mäta<em> In Vivo</em> Mitochondrial oxidativ fosforylering Kapacitet i human skelettmuskel

Summary

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (³¹PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Abstract

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (³¹PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo ³¹PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. ³¹PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for ³¹PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Introduction

Målet med detta arbete är att beskriva en reproducerbar metod för att icke-invasivt mäta in vivo skelettmuskel mitokondriefunktion hos individer som har ett brett spektrum av förmågor. Avvikande mitokondriefunktion är ett kännetecken för ett brett spektrum av metabolt syndrom och genetiska sjukdomar, från vanliga tillstånd såsom åldrande och diabetes sällsynta sjukdomar såsom Friedreichs ataxi.

Metabola syndromet och mitokondriell dysfunktion

Metabola syndromet har visat sig störa mitokondriefunktion, tryck skelettmuskel OXPHOS, och leda till ektopisk fettansamling i skelettmuskel ^{1, 2.} Som kritiska organ reglerar ämnesomsättning och energi homeostas är mitokondrier inblandade i patofysiologin av fetma ^{3, 4,} insulinresistens ⁵ </sup>, Typ 2 diabetes mellitus (T2DM) ^{6, 7,} diabetesrelaterad mikro- ^{8, 9, 10, 11} och makrovaskulära komplikationer ^{12, 13,} och alkoholfri fettlever (NAFLD) ^{14, 15, 16,} bland andra .Insulin motstånd kännetecknas av stora förändringar i skelettmuskulaturen mitokondriell aktivitet, inklusive minskad mitokondriell trikarboxylsyra (TCA) flödeshastighet, ATP synteshastighet och citrat syntas och NADH: O ₂ oxidoreduktas aktivitet ^5. En hypotes är att dessa förändringar kan bero på ansamling av fria fettsyror (FFA) metaboliter i muskeln, som påtagligt förstärks under fetma och andra fetma-rupprymd sjukdomar ^{2, 17.} Exponeringen av muskler för förhöjda ffas och lipid intermediärer kan minska uttrycket av gener i lipid oxidativ väg liksom TCA-cykeln och elektrontransportkedja (ETC) ^18. Denna minskning av mitokondriell skelettmuskel OXPHOS kapacitet i fastställandet av en lipid överbelastning åtföljs av en nedgång i den kvantitativa (innehåll och biogenes av mitokondrier) ¹⁹ och kvalitativ funktion av skelettmuskulatur mitokondrier ^20. Exponera skelettmuskler och myocyter till ffas leder till svår insulinresistens, och ökad FFA-upptag i muskel är associerad med insulinresistens hos både människor och gnagare ^21. Lipiden intermediärer ceramid och diacylglycerol (DAG) har visat sig direkt hämma insulinsignaleringsvägen genom att förändra aktiviteten av kinaser, såsom proteinkinas C och protein kinas B ^21. Därför lipid-härledda molekyler tycks spela en framträdande roll i utvecklingen av skelett motstånd muskel insulin och T2DM. Det är dock fortfarande oklart om förändringar i mitokondriernas kapacitet är en orsak eller en följd av insulinresistens ^22.

Friedrichs ataxi och mitokondriell dysfunktion

Minskat OXPHOS kan också uppstå från genetiska defekter. Friedrichs ataxi (FA), den vanligaste formen av ärftlig ataxi, är en genetisk sjukdom som orsakas av en mutation i frataxin (FXN) genen, vilket resulterar i intra-mitokondrie järn ackumulering, reaktiva syreproduktion art, och avvikelser i oxidativ fosforylering ^{23, 24, 25, 26.} Denna viktiga upptäckt har lett till utvecklingen av riktade terapier, which syfte att förbättra mitokondriefunktion vid undercellnivå. Trots denna insikt, har det varit begränsade utvecklingen av in vivo, reproducerbara biomarkörer för FA klinisk forskning. I själva verket är en kritisk barriär i effektiv utvärdering av riktade terapier i FA oförmåga att spåra ändringar i mitokondriefunktion. Aktuella funktionella åtgärder, till exempel, kan identifiera minskad hjärtminutvolym; emellertid, de är oförmögna att bestämma den nivå vid vilken dysfunktion inträffar (figur 1). Utvecklingen av en tillförlitlig markör för mitokondriefunktion som kan användas för att identifiera och utvärdera sjukdomsprogression i Friedrichs ataxi är avgörande för att bedöma relevanta mekanistiska inverkan av riktade terapier.

Nedsatt OXPHOS och hjärtdysfunktion

Avvikande mitokondriefunktion, antingen förvärvas eller genetiska, skulle kunna bidra till utveckling eller progression av koftaac dysfunktion. Enligt villkoren i övertryck och hjärtsvikt, de primära energisubstrat preferens växlar från FFA glukos. Detta är förenat med minskad ETC aktivitet och oxidativ fosforylering ^27. Patofysiologi mitokondriella bioenergetik i hjärtdysfunktion kan vara olika beroende på den primära ursprung mitokondriell defekt. Diabetes och metabolt syndrom resulterar i mitokondriella avvikelser i hjärtmuskeln, såsom försämrad biogenes och fettsyrametabolism, vilket leder till minskad substrat flexibilitet, energieffektivitet, och så småningom, diastolisk dysfunktion ^{28, 29.} I FA, å andra sidan, en frataxin brist resulterar i betydande mitokondriell järnackumulering i kardiomyocyter ^{30, 31.} Järn ackumulering leder till produktion av fria radikaler via Fenton reaktion ^{32 <}/ Sup> och ökar risken för fri radikal-inducerad cardiomyocyte skada. Intra-mitokondrie järn ackumulering är också förknippat med en ökad känslighet för oxidativ stress och minskad oxidativ kapacitet ^{30, 31.} Järn anhopning och efterföljande avvikande mitokondriefunktion, på grund av frataxin brist, därför kan vara ansvarig för nedsatt hjärt energin och kardiomyopati observerades i FA ^{33, 34.} Det är också intressant att notera att den minskade oxidativ kapacitet i skelettmuskulaturen mitokondrier paralleller träningsintolerans och minskad metabolisk kapacitet i hjärtsvikt (HF) ^35. Mätning av skelettmuskel OXPHOS kapacitet, som beskrivs häri, är lätt genomförbara och robusta; i kombination med betydelsen av skelettmuskulaturen OXPHOS i HF, dessa egenskaper gör det till en tilltalande biomarkör i omfattande studier av hörat sjukdom ^36.

Nedsatt OXPHOS och åtföljande hjärtsvikt är inte en obetydlig del av metabola och mitokondriell sjukdom. Patienter med diabetes och metabola sjukdomar löper större risk att utveckla hjärt-kärlsjukdom och har överdödlighet efter hjärtinfarkt (MI) ^{37, 38, 39, 40, 41;} över hälften av FA patienter har kardiomyopati, och många dör av hjärtarytmi eller hjärtsvikt ^42. Därför kan kvantifiering av minskad OXPHOS inte bara att för tidig upptäckt och behandling av hjärtdysfunktion, men det kan också lindra en stor klinisk börda i dessa sjukdomar.

Riktade terapier för att direkt öka OXPHOS kapacitet är ett lovande område för att förbättra behandlingen av patienter, whether orsaken till metabola dysfunktion är genetisk eller förvärvad. För närvarande är utvecklingen av nya målinriktade läkemedel som antingen lindra onormal mitokondriefunktion ⁴³ eller korrigera den primära genetiska defekten ⁴⁴ kan förbättra rubbade bioenergetik karakteristisk för FA. I fallet med förvärvad mitokondriell dysfunktion, kan ökad fysisk aktivitet förbättrar mitokondriefunktion ^{45, 46, 47.}

³¹ Fosfor magnetisk resonansspektroskopi som en icke-invasiv Biomarker av mitokondrie funktion

Oavsett den testade terapi, en integrerad in vivo bedömning av skelettmuskel bioenergetik är ett viktigt verktyg för att bedöma effekterna av riktade insatser, särskilt hos patienter med svår träningsintolerans eller oförmåga att genomgå konventionell metabolic testning. Magnetisk resonansspektroskopi inställd på fosfor ⁽³¹ PMRS), en endogen kärna finns i olika hög energisubstrat i celler i hela kroppen, har använts för att kvantifiera mitokondrie oxidativ kapacitet med hjälp av olika metoder, bland annat i-magnet motion-återvinningsprotokoll och muskelstimuleringsprotokoll ^48. Övningen-återhämtning protokoll förlitar sig på en mängd olika apparater varierar i komplexitet från MR-kompatibla ergometrar som reglerar och mäter arbetsbelastning enkla konfigurationer av remmar och kuddar som möjliggör burst-typ resistiv och kvasistatisk övning. Ett av de primära målen för någon av dessa protokoll är att producera en energi obalans som kravet på adenosintrifosfat (ATP) initialt tillgodoses genom den enzymatiska nedbrytningen av phosphocreatine (PCR) genom kreatinkinas reaktion ^49. Vid upphörande av motion, är hastigheten för ATP-produktion domineras av oxidativ phosphorylation och representerar den maximala in vivo kapacitet mitokondrier ^50. Vidare kan OXPHOS under eftertränings återhämtning att beskrivas av en första ordningens reaktionshastighet ^51. Efter utöva återhämtning av PCR kan därför kvantifieras genom montering av en exponentiell tidskonstant (τ _PCR), med mindre värden på τ _PCr representerar större kapacitet för oxidativ ATP-syntes. Betydande ansträngningar har gjorts för att validera ³¹ PMRS mot ex vivo och mer direkta åtgärder OXPHOS och demonstrera potentiella kliniska användbarheten av denna teknik ^{52, 53, 54, 55.}

Noterbart kan protokollet beskrivs i detta arbete genomförs på kliniskt tillgängliga skannrar, och det har i stor utsträckning godkänts som en icke-invasiv biomarkör of mitokondriefunktion ^56. Men en övning ³¹ PMRS protokoll optimerad för användning till personer med olika svårighetsgrader av neuromuskulär försämring eller rörlighet har inte väletablerade ^57. En väldefinierad, brett tillämplig övningsprotokoll och ³¹ PMRS teknik skulle vara särskilt användbar vid utvärdering av sjukdomar med grundläggande avvikelser i mitokondriefunktion.

Flera tidigare studier har undersökt tillämpningar av icke-invasiva metoder för att kvantifiera mitokondriefunktion hos patienter. Till exempel, har dessa tekniker visat nedsatt OXPHOS hos patienter med typ 2-diabetes ^36. Lodi et al. först testat genomförbarheten av PMRS tekniker hos försökspersoner med FA och fann att 1) ​​den grundläggande genetiska defekten i FA försämrar skelettmuskel OXPHOS och 2) antalet GAA triplett upprepar är omvänt proportionell mot skelettmuskulaturen OXPHOS ^33. Mer nyligen, Nachbauer et al. begagnade PMRS som en sekundär resultatmått i en FA drogprov med 7 ämnen. PCr återhämtningstider var signifikant längre hos patienter jämfört med kontroller, bekräftar Lodi tidigare arbete och indikerar att effekterna av avvikande frataxin uttryck i FA kan leda till en nedgång i mitokondrie kapacitet som kan detekteras med hjälp av PMRS tekniker ^58.

Tillförlitliga metoder för att adekvat definiera in vivo skelettmuskelfunktion i en realistisk, kostnadseffektiv och reproducerbart sätt är avgörande för att förbättra ämnes utfall i en rad sjukdomar som påverkar mitokondriell funktion.

Detta arbete beskriver ett stabilt förfarande för att erhålla in vivo maximal oxidativ kapacitet i skelettmuskulaturen med hjälp av ³¹ PMRS. Den in-magnet övningsprotokollet tolereras väl av individer som spänner över ett brett spektrum av fysiska och functional förmågor och ger en förenklad ämne inställning med billig och allmänt tillgänglig utrustning.

Protocol

Detta protokoll har godkänts av och följer riktlinjerna i Ohio State University Institutional Review Board för försöksperson. Det är oerhört viktigt att alla förfaranden som rör MR utrustning utförs av tillräckligt utbildad personal som ansluter sig till de högsta normerna för MR-säkerhet 59. 1. Material och förberedelser Se till att alla nödvändiga material finns tillgängliga före experimentet (Figur 2). …

Representative Results

reproducerbarhet Studie Sex frivilliga (4 män och 2 kvinnor, medelålder: 24,5 ± 6,2 år) utan självrapporterade hjärta, metaboliska eller mitokondriell sjukdom genomgick sessioner av den beskrivna 31 PMRS motion och bildteknik på 2 olika dagar inom en vecka för att utvärdera teknik reproducerbarhet (figur 6a). De studier som gjorts på normala frivilliga bekräftar reproduce…

Discussion

Detta dokument beskriver ett standardprotokoll för ³¹ PMRS undersökning som ger seriella och icke-invasiv in vivo mätning av skelettmuskel mitokondriefunktion. Protokollet har betydande överklagande när man överväger bredden av undersökningar inriktade på växande bördan av metabola syndromet och dess resulterande sjuklighet och dödlighet. Denna ³¹ PMRS protokollet kräver en minimal mängd av scanner tid och kan införlivas i omfattande metaboliska undersökningar hos patienter…

Materials

1.5 T MR Scanner	Siemens		manufacturer will not affect results
10 cm 31P transmit-receive coil, 1.5T compatible	PulseTeq		manufacturer will not affect results
3 fl oz Baby Oil	Johnson & Johnson		manufacturer will not affect results
Foam triangle cushion (Knee)	Siemens		manufacturer will not affect results
(3) plastic buckle resistive straps; table to table	Siemens		manufacturer will not affect results
(1) plastic buckle resistive strap; self-connecting	Siemens