Bruken av<em> Ex Vivo</em> Hel-organ Imaging og kvantitativ Tissue Histologi fastslår Bio-distribusjon av fluorescensmerkede molekyler

Summary

Ex vivo hel-organ avbildning er en hurtig metode for å bestemme de relative konsentrasjoner av fluorescensmerkede forbindelser innenfor og mellom vev eller behandlingsgruppene. Omvendt, kvantitativ fluorescens histologi, mens mer arbeidskrevende, gjør det mulig for kvantifisering av de absolutte vevsnivåer av merkede molekyler.

Abstract

Fluorescerende merking er en godt etablert prosess for å undersøke skjebnen av merkede molekyler under forskjellige eksperimentelle betingelser både in vitro og in vivo. Fluorescerende prober er spesielt nyttige for å bestemme bio-fordelingen av administrert store molekyler, hvor tilsetningen av en liten-molekyl fluorescerende markør antas ikke å påvirke kinetikken eller bio-fordeling av forbindelsen. En rekke metoder eksisterer for å undersøke bio-fordeling som varierer betydelig i mengden av anstrengelse som kreves, og hvorvidt de resulterende målingene er fullstendig kvantitativt, men ved hjelp av flere metoder i kombinasjon kan gi en hurtig og effektivt system for å analysere bio-distribusjoner.

Ex vivo hel-organ avbildning er en metode som kan brukes til raskt å sammenligne de relative konsentrasjoner av fluorescerende molekyler i vev og mellom flere typer vev eller behandlingsgruppene. Ved hjelp av en avbildning platskjema designet for live-dyr eller hel-organ imaging, fluorescens innen intakte vev kan bestemmes uten videre behandling, noe som sparer tid og arbeid samtidig som det gir et riktig bilde av den samlede bio-distribusjon. Denne prosessen er ideelt i forsøk forsøker å bestemme vevsspesifisiteten av en forbindelse eller for sammenligning av flere forskjellige forbindelser. Kvantitativ vev histologi på den annen side krever omfattende videre behandling av vev for å skape et kvantitativt mål på de merkede forbindelser. For å vurdere bio-fordeling nøyaktig, må alle vev av interesse være skiver, skannes, og analysert i forhold til standardkurver for å foreta sammenligninger mellom vev eller grupper. Kvantitativ vev histologi er gullstandarden for å bestemme absolutte sammensatte konsentrasjoner i vev.

Her beskriver vi hvordan begge metoder kan benyttes effektivt sammen for å vurdere evnen til forskjellige administrasjonsmetoder and sammensatte modifikasjoner til målet og levere fluorescerende merkede molekyler til sentralnervesystemet ^1.

Introduction

Fluorescerende merking er en lett utnyttes og effektiv fremgangsmåte for å bestemme bio-fordeling av forbindelser, ved hjelp av et utvalg av utstyr som er felles for mange laboratorier. Fluoroforer er allment tilgjengelig, relativt billig, og kommer i en rekke forskjellige bølgelengder, slik at flere merkede molekyler kan benyttes samtidig uten forstyrrelser. De fleste fluoroforer har en rekke kjemikalier for konjugering til forskjellige reaktive grupper på målforbindelser, og prosessen med konjugering er vanligvis en enkel prosess for de fleste typer av reaktive seter. I tillegg er det utstyr som kreves for målingene av fluorescensmerkede forbindelser er vanlig i mange laboratorier. Fluorescent mikroskoper, kameraer og lysbilde skannere kan alle brukes i ulike situasjoner, som gjør bruk av fluorescerende merking svært tilgjengelig. Fluorescerende markører blir ofte brukt til å bestemme den biologiske fordeling og kinetikken av forbindelser både in vivo og ex vivo med live bildebehandlingsenheter, for eksempel IVIS Spectrum Imager, og ved kvantitativ vev histologi ^2,3.

Bruken av ex vivo hel-organ avbildning ved hjelp live bildebehandlingsenheter har økt over tid på grunn av sin brukervennlighet og evne til raskt å lage en nøyaktig sammenligning av de relative konsentrasjoner av merkede forbindelser uten at den videre behandlingen av tissues4. Men mens ex vivo hel-organ bildebehandling kan gi rom for enkel analyse og sammenligning, det ikke genererer et kvantitativt mål for absolutte sammensatte konsentrasjoner i en vev. Dette skyldes lysspredning effekter i intakte organer. Siden lysspredning (og, i mindre grad, absorbans) varierer fra vev størrelse og tetthet, kan hel-organ avbildning under vevsnivåer i store eller tette organer. Formulering aktuelle standarder for absolutte konsentrasjonsmålinger er også vanskelig fordi man må etterligne tykkelsenog densitet på hvert enkelt organ. På den annen side, er hel-organ avbildning en rask metode for å skaffe de relative vevsnivåer av et middel, og det er ideell for å sammenligne den relative biologiske fordeling av flere beslektede molekyler (slik som i legemiddel rettet mot studier). En alternativ strategi er å benytte kvantitativ fluorescens histologi, en teknikk som er avledet fra metoden til kvantitativ autoradiografi, for å oppnå absolutte vevsnivåer av et testmiddel ^5,6. Snarere enn å plassere en hel dyr eller organ i en forestillingsevne enhet, krever kvantitativ vev histologi at hvert vev være skiver, montert på lysbilder, skannet, og analysert individuelt. Standarder av testmidlet fremstilles og skiver med samme tykkelse som de organprøvene. Ved å kutte alle organer og standarder til den samme tykkelse, er variasjonen på grunn av lysspredning eller absorbans elimineres, og vev fluorescens intensitet kan være egnet til å standardkurven for å bestemme absolutte concentrasjon. Selv om denne fremgangsmåten, når det gjøres riktig, er kvantitativ, er det også arbeidskrevende og lett misbrukes. Gitt mer komplekse natur av kvantitative histologi og betydelig høyere pris på arbeidskraft sammenlignet med hel-organ bildebehandling, blir det verdt å undersøke hvor hver prosess er mest praktisk å bruke når undersøke bio-fordeling av fluorescensmerkede forbindelser. Denne protokollen gir en detaljert beskrivelse av hvordan disse metodene kan brukes sammen for effektivt å sammenligne den biologiske fordeling av rhodaminmerkede Elastin-lignende polypeptid (ELP), med eller uten tilsetning av SynB1 eller Tat-cellepenetrerende peptider, via intranasal (IN) og intravenøs (IV) administrasjonsveier.

Protocol

MERK: All bruk av dyr i denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Mississippi Medical Center. 1. Behandling av dyr og vev Administrasjon og Sacrifice Bedøve dyrene ved anvendelse av 3% isofluran i 5 minutter og verifisere anestesidybden ved å observere fravær av tå-klemme refleks. Påfør veterinær salve til øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi. Vei dyret og pipetter a / kg dose av enten rhod…

Representative Results

Dataene nedenfor beskriver levering av tre forbindelser: en narkotika-levering vektor kjent som ELP og to versjoner av ELP modifisert med celle-gjennomtrengende peptider (SynB1-ELP og Tat-ELP) 9. Alle tre forbindelser ble merket med tetramethylrhodamine-5-maleimide og levert via to administrasjonsveier (IN og IV). Målet med disse eksperimentene var å bestemme hvilken forbindelse og tilførselsvei vil resultere i den beste penetrasjon inn i sentralnervesystemet (CNS) 3. <p class="jove_content"…

Discussion

Mens ex vivo hel-organ bildebehandling er generelt grei, kan det tilslutning til noen grunnleggende begreper og teknikker forbedre nøyaktigheten av bio-distribusjons målinger. Korte bølgelengder av lys oppleve en høy grad av spredning og absorpsjon i de fleste vev, som i betydelig grad påvirker nytten av kort bølgelengde fluorophores de. Disse fluoroforer har begrenset anvendelse i dype vev studier, men de har vært brukt effektivt i eksperimenter ser på overflaten vev eller inn i øyet. Omvendt, lange b…

Materials

Reagents
Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)	Thermo Fisher	T6027, A20342	Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling
Phosphate Buffered Saline	Sigma	1002243569	PBS Buffer for rinsing
Optimal Cutting Temperature Compound	Tissue-Tek	4585	Used for freezing and mounting
Equipment
IVIS Spectrum	Perkin Elmer		For ex vivo whole organ imaging
Cryomicrotome	Thermo		For cryosectioning
Fluorescence slide scanner	Perkin Elmer		For slide scanning