Использование<em> Ex Vivo</em> Обработки изображений цельнозерновой органов и тканей Количественные гистологии, чтобы определить, био-распределение флуоресцентно меченых молекул
Summary
Ex естественных изображений целого органа является быстрый метод для определения относительных концентраций флуоресцентно меченых соединений внутри и между тканями или группами лечения. С другой стороны, количественная флуоресцентная гистологии, в то время как более трудоемок, позволяет для количественного определения абсолютных уровней тканевых меченых молекул.
Abstract
Флуоресцентная маркировка представляет собой хорошо установленный процесс для изучения судьбы меченых молекул при различных экспериментальных условиях в пробирке и в естественных условиях. Флуоресцентные зонды особенно полезны при определении био распределение вводимых крупных молекул, где добавление метки флуоресцентного малой молекулы вряд ли повлияет на кинетику или биологическое распределение соединения. Различные методы существуют для изучения био-распределения, которые существенно различаются по объему требуемых усилий, и являются ли полученные результаты измерений полностью количественный, но с использованием нескольких методов в сочетании могут обеспечить быструю и эффективную систему для анализа био-распределения.
Экс естественных изображений целого органа является методом , который может быть использован , чтобы быстро сравнить относительные концентрации флуоресцентных молекул в тканях , так и между различными типами тканей или групп лечения. Использование Plat изображенийФорма предназначена для живого животного или изображения целого органа, флуоресценция в пределах здоровых тканей может быть определена без дальнейшей обработки, экономии времени и труда, обеспечивая точную картину общего биологического распределения. Этот процесс является идеальным в экспериментах, пытающимися определить тканевую специфичность соединения или для сравнения нескольких различных соединений. Количественный гистологию ткань с другой стороны, требует обширной дальнейшей обработки тканей, с тем чтобы создать количественную меру меченых соединений. Для того, чтобы точно оценить биологическое распределение, все ткани интерес должен быть нарезан, отсканированы и проанализированы относительно стандартных кривых для того, чтобы проводить сравнения между тканями или группами. гистологии Количественный ткань является золотым стандартом для определения абсолютных концентраций составных в тканях.
Здесь мы описываем, как оба метода могут быть использованы вместе эффективно для оценки способности различных методов администрационныхе составные модификации целевой и доставить флуоресцентно меченных молекул в центральной нервной системе 1.
Introduction
Флуоресцентная маркировка легко используется и эффективный метод для определения био- распределения соединений, с использованием целого ряда оборудования, которое является общим для многих лабораторий. Флуорофоры широко доступны, относительно недорог, и бывают различных длин волн, таким образом, что несколько меченых молекул могут быть использованы одновременно без помех. Большинство флуорофоры имеют диапазон химических составов для конъюгации с различными реакционноспособными группами целевых соединений, и процесс конъюгации, как правило, простой для большинства типов реакционноспособных участков. Кроме того, оборудование, необходимое для измерения флуоресцентно меченых соединений являются обычным явлением во многих лабораториях. Флуоресцентные микроскопы, тепловизоры, и слайд-сканеры могут быть использованы в различных условиях, что делает весьма доступным использование флуоресцентных меток. Флуоресцентные метки часто используются для определения био распределения и кинетика соединений как в естественных условиях и бывший ЛьвовскийO с живыми устройств обработки изображений, таких как IVIS Spectrum Imager, а гистологически количественного ткани 2,3.
Использование бывших естественных изображений целого органа с использованием устройств визуализации живых увеличилось с течением времени из – за их простоты использования и возможность быстро создать точное сравнение относительных концентраций меченых соединений без необходимости дальнейшей обработки tissues4. Тем не менее, в то время как бывший естественных изображений целого органа может позволить легко проводить анализ и сравнение, он не создает количественную меру абсолютных концентрациях соединения в пределах ткани. Это происходит из-за световых эффектов рассеяния внутри интактных органов. Так как рассеяние света (и, в меньшей степени, абсорбция) варьируется в зависимости от размера и плотности ткани, изображения целого органа могут недооценивать уровни ткани в больших или плотных органов. Формулирование соответствующие стандарты для абсолютных измерений концентрации также трудно, потому что нужно имитировать толщинуи плотность каждого отдельного органа. С другой стороны, изображения целого органа является быстрый способ получения относительных уровней ткани агента, и он идеально подходит для сравнения относительной био-распределения, связанных с несколькими молекулами (например, в исследованиях лекарственных препаратов). Альтернативной стратегией является использование количественного флуоресцентного гистологию, технику , полученную из метода количественной авторадиографии, чтобы получить абсолютные уровни ткани тестируемого агента 5,6. Вместо того, чтобы помещать весь животное или орган в воображая устройство, количественное гистологии ткани требует, чтобы каждая ткань быть нарезано, смонтированный на салазках, отсканированные и анализировали по отдельности. Стандарты тестируемого агента получают и нарезанные на той же толщины, что и образцы органов. Сокращая все органы и стандарты для той же толщины, вариативность из-за рассеяния света или поглощения устраняется, и интенсивность флуоресценции ткани может быть пригодным для стандартной кривой, чтобы определить абсолютную ОБОГАЩЕНИЯрацион. Хотя этот метод, когда сделано должным образом, количественный, но и трудоемкий и легко засланный. С учетом более сложный характер количественного гистологии и значительно более высокой стоимости рабочей силы, по сравнению с изображениями целого органа, становится целесообразно рассмотреть, где каждый процесс является наиболее практично использовать при рассмотрении био распределение флуоресцентно меченых соединений. Этот протокол содержит подробное описание того, как эти методы могут быть использованы вместе, чтобы эффективно сравнивать биологическое распределение родамин-меченого Эластин-подобный полипептид (ELP), с добавлением или без добавления клеток проникающим пептидов SynB1 или Tat, используя как интраназально (IN) и внутривенные (IV) пути введения.
Protocol
Representative Results
Discussion
В то время как бывший естественных изображений целого органа , как правило , проста, приверженность некоторых основных понятий и методов может повысить точность измерений био-распределения. Короткие длины волн света опыта высокая степень рассеяния и поглощения в большинстве ткан…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.
Materials
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
References
- George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).
- George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis. Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).
- Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &, D. Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model. PLoS One. 8 (1), (2013).
- Liu, H., Zhang, W., et al. The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages. Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).
- Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography. Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).
- Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy. J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. E. Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain. J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).
- Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &, D. Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative. Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).
- Vugmeyster, Y. Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges. World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).
- Stumpf, W. E. Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals – Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).
