の用法<em> ex vivoで</em>全体の臓器イメージングと定量的組織組織学は、蛍光標識分子のバイオ分布を決定します
Summary
エキソビボ全臓器のイメージングは、内および組織または治療群間で蛍光標識された化合物の相対濃度を決定するための迅速な方法です。逆に、蛍光組織学、定量的には、より労働集約しながら、標識された分子の絶対的な組織レベルの定量化を可能にします。
Abstract
蛍光標識は、 インビトロおよびインビボの両方の実験様々な条件下で標識された分子の運命を調べるための十分に確立されたプロセスです。蛍光プローブは、低分子の蛍光標識の付加は、反応速度や化合物の生体分布に影響を与えにくい投与巨大分子の生体内分布を決定する際に特に有用です。種々の方法は、必要な作業の量で、得られた測定値は完全に定量的であるが、一緒に複数の方法を使用して生体分布を分析するための迅速かつ効果的なシステムを提供することができるかどうかを著しく変化生体内分布を調べるために存在します。
エキソビボ全器官イメージングを迅速組織内および組織または処置群の複数の種類の間で蛍光分子の相対濃度を比較するために使用することができる方法です。イメージングPLATを使用生きた動物または全臓器のイメージングのために設計されたフォームは、無傷の組織内の蛍光は、全体的な生体分布の正確な画像を提供しながら、時間と労力を節約し、さらに処理することなく決定することができます。このプロセスは、化合物または複数の異なる化合物を比較するための組織特異性を決定しようとする実験に理想的です。一方、定量的組織の組織像は、標識化合物の定量的尺度を作成するために、組織の大規模な更なる処理を必要とします。正確に生体内分布を評価するために、関心のあるすべての組織が、スライススキャンされ、組織やグループ間の比較を行うために標準曲線と比較して分析する必要があります。定量的組織の組織学は、組織内の絶対化合物濃度を決定するためのゴールドスタンダードです。
ここでは、両方の方法は、異なる投与方法の能力を評価するために一緒に有効に使用することができる方法を説明しますND化合物の変更は、中枢神経系1に蛍光標識分子を標的とし、提供します。
Introduction
蛍光標識は、多くの研究室に共通の装置の範囲を使用して、化合物の生体分布を決定するために容易に利用され、効果的な方法です。フルオロフォアは、比較的安価で広く入手可能であり、かつ複数の標識分子が干渉することなく同時に使用することができるような種々の波長を、来ます。ほとんどのフルオロフォアは、標的化合物上の異なる反応基への結合のための化学の範囲を持っている、および結合のプロセスは、反応部位のほとんどのタイプのため、一般的に簡単です。さらに、蛍光標識された化合物の測定に必要な機器は、多くのラボで共通しています。蛍光顕微鏡、イメージャ、およびスライドスキャナはすべて非常にアクセス可能な蛍光標識を利用して、さまざまな状況で使用することができます。蛍光標識は、しばしば、インビボおよびエクスビボVIV両方の化合物の生体分布および動態を決定するために使用されますこのようなIVISスペクトラムイメージャーなどのライブイメージングデバイス、とO、および定量的な組織の組織学2,3によって。
ライブ画像化装置を用いてエクスビボ全臓器のイメージングの使用は、使用および迅速tissues4のさらなる処理を必要とせずに標識された化合物の相対濃度の正確な比較を作成することが容易に経時的に増加しています。 ex vivoで全臓器イメージングは簡単に分析し、比較を可能にすることができますしながら、しかし、それは組織内の絶対化合物濃度の定量的尺度を生成しません。これは、無傷の臓器内の光散乱効果によるものです。光散乱（及び、より少ない程度に、吸光度）が組織の大きさや密度によって変化するため、全体の臓器イメージングは、大規模または高密度の器官における組織レベルを過小評価することができます。 1の厚さを模倣する必要があるため、絶対濃度測定のための適切な基準を策定することも困難です各個々の器官の密度。一方、全臓器造影剤の相対的な組織レベルを得る迅速な方法であり、（例えば、薬物標的化の研究のように）多数の関連分子の相対的な生体分布を比較するために理想的です。別の戦略は、定量的な蛍光組織学、定量的オートラジオグラフィーの方法に由来する技術を利用する試験薬剤5,6の絶対的な組織レベルを得ることです。むしろ想像デバイスに動物全体または器官を配置するよりも、定量的な組織の組織学は、各組織が、スライスされたスライド上に載せ、スキャンされ、個別に分析されている必要があります。試験物質の標準を調製し、臓器サンプルと同じ厚さにスライスします。同じ厚さに全ての器官および標準を切断することにより、光の散乱又は吸収に起因するばらつきが解消され、組織の蛍光強度は、絶対的なコンセントを決定するための標準曲線にフィットすることができ配給。適切に行われ、この方法は、定量的であるが、それはまた、労働集約的かつ容易に取り扱いを誤ったです。全臓器のイメージングと比較した場合、定量的な組織学及び労働の有意に高いコストのより複雑な性質を考えると、それは、各プロセスは、蛍光標識された化合物の生体内分布を調べるときに使用するのが最も実用的である場合を調べることは価値になります。このプロトコルを介して、SynB1又はTAT細胞透過性ペプチドの添加の有無にかかわらず、これらの方法は効果的にローダミン標識エラスチン様ポリペプチド（ELP）の生体分布を比較するために一緒に使用することができる方法の詳細な説明を提供します鼻腔内（IN）および静脈内（IV）投与経路。
Protocol
Representative Results
Discussion
ex vivoで全臓器イメージングは、一般的には簡単ですが、いくつかの基本的な概念や技術への付着は、生体内分布測定の精度を向上させることができます。光経験の短い波長ほとんどの組織で散乱し、吸光度の高い、大きな影響を及ぼし短波長蛍光体の有用性。これらのフルオロフォアは、深い組織の研究に適用が限定されているが、彼らは表面組織で、または眼に見ての実験で効果?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.
Materials
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
References
- George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).
- George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis. Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).
- Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &, D. Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model. PLoS One. 8 (1), (2013).
- Liu, H., Zhang, W., et al. The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages. Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).
- Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography. Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).
- Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy. J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. E. Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain. J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).
- Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &, D. Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative. Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).
- Vugmeyster, Y. Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges. World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).
- Stumpf, W. E. Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals – Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).
